不同消毒剂及激素对黄果西番莲茎段组织培养的影响①

黄东梅 吴 斌 马伏宁 陈 弟 宋 顺

(中国热带农业科学院海口实验站/海南省香蕉遗传改良重点实验室 海南海口571101)

西番莲（Passiflora edulisSims）又名百香果、热情果（passion fruit），为热带、亚热带多年生半木质藤本常绿果树，原产澳大利亚和南美洲，目前在全球热区有广泛种植。中国西番莲主栽品种有紫果种（P. edulis）、黄果种（P.edulisf.flavicarpa）、杂交种三大类。西番莲果实香味多样浓郁，且富含多种维生素、氨基酸及微量元素，风味独特，营养丰富，深受消费者喜爱，具有较高的经济效益，适宜推广种植［1-2]。目前影响西番莲种植推广的一个重要因素是健康无毒种苗的获得。已发表的影响百香果的病毒记录有近20 种，病毒潜伏期长，扩散迅速，严重时可造成全株死亡甚至蔓延至整个果园，造成较大的经济损失，因此，亟需开发完善的脱毒技术［3-4]。植物的组织培养具有繁殖系数大、周期短、去除病毒迅速等优点，可作为脱毒技术的一个重要手段［5]。关于西番莲组培技术目前有少量文献报道，外植体一般选择叶片［6-7]、茎段［8-9]、幼嫩卷须［10]和下胚轴［11]等，其中以茎段为材料报道最多。Prithviraj 等［7]以叶片为外植体，在MS＋6-BA 3.0 mg/L 培养基上分化率98%，增殖效率可达到100株/每外植体；张琴等［11]研究发现，以紫果西番莲下胚轴的分化效率较子叶高，下胚轴在MS＋6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L 培养基上不定芽分化率最高；陈发兴［12]以紫果西番莲的叶盘、叶柄、茎段、卷须为外植体直接诱导不定芽结果表明，叶盘和卷须诱导不定芽比较困难，而叶柄相对容易，茎段在ZEA 达到2～3 mg/L 时，外植体萌芽率高达100%；Pipino 等［10]以西番莲杂交品种“Guglielmo Betto” 幼嫩腋生卷须为外植体在MS基本培养基添加49.20 μmol/L 2-IP和2.68 μmol/L NAA 或4.43 μmol/L 6-BA 和11.41 μmol/L IAA 可直接分化出不定芽，其中前者芽分化率可达90%。西番莲的组培技术还难以推广应用于种苗繁育，主要受限于基因型差异大、外植体的消毒难、增殖系数低、生根效率低等技术瓶颈。本研究对象为南美引进试种成功的黄果西番莲，该品种果皮黄色，果肉橙红色，果型较现有主推品种大，果肉量多，酸甜比值优异，具有较高的经济价值。本试验拟对消毒剂、激素等影响黄果西番莲茎段组培快繁的因素进行研究，以保持母本的优良性状，为后期种质保存及健康无毒种苗生产、种植和推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验以从南美引进的在澄迈县白莲基地适应性种植的黄果西番莲（Passiflora edulisf.flavicarpa）为材料，选取一年生、生长健康的茎段。

1.2 方法

1.2.1 外植体的预处理及消毒

选取田间采集的茎段，流水冲洗表面，浸泡于0.2%高锰酸钾溶液中进行初步消毒处理，后扦插于水培培养基中，定期更换培养基［13]，培养一段时间后，选取新生的幼嫩茎段作为外植体。外植体的消毒首先用70%酒精消毒30 s，继而选用0.1% HgCl2或2% NaClO 溶液消毒，处理时间包括10、15、20 min，后用无菌水冲洗3～5 次，用无菌滤纸将外植体表面的水吸干，接种至芽诱导培养基上，以MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 为基本芽诱导培养基，试验采用完全随机试验设计，每个处理组合10 个外植体，重复3 次。观察外植体污染及生长情况并记录，根据结果筛选合适的消毒药剂和消毒时间。

污染率＝（污染外植体总数/外植体总数）×100%

未污染存活率＝（未污染且外植体接种10 d后仍保持绿色外植体数/未污染外植体总数）×100%。

1.2.2 不同激素浓度对西番莲茎段芽诱导的影响

激素选用细胞分裂素6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L） 和 生 长 素IAA （1.0、2.0 mg/L） 或NAA（0.1、0.3 mg/L）接种表面消毒处理好的外植体，完全随机组合试验设计，共12 个处理组合，每个处理组合9 个外植体，重复3 次。根据统计结果筛选最优化的芽诱导培养基。

1.2.3 不同激素浓度对生根诱导的影响

再生芽经过增殖壮苗长至2～3 cm 后，将芽切下，转至添加IBA（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）的1/2 MS 培养基中进行生根诱导，每个处理接种3瓶，每瓶接1 株，重复3 次，观察并统计生根情况，筛选最佳生根培养基。

1.2.4 数据分析与处理

试验数据采用Excel 2016 进行统计分析，不同处理之间采用LSD 法进行差异显著性检验（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理污染情况

随着消毒时间的增加，污染率呈下降的趋势，未污染存活率呈平稳后下降的趋势，表明消毒处理时间越长消毒越彻底但同时外植体越容易受消毒液毒害，0.1% HgCl2的消毒效果好于2% NaClO（表1）。选择污染率低且外植体存活率高的组合为最优化的消毒处理方法，即0.1% HgCl2处理15 min。

表1 不同消毒处理对西番莲茎段芽诱导的影响

2.2 不同激素对芽诱导的影响

外植体在芽诱导培养基上受细胞分裂素和生长素的综合影响，培养一周左右逐渐膨大，随着培养时间的推进，有在茎段节点冒出数个芽点，也有仅茎段膨大在切口处长出新生细胞堆积形成瘤状愈伤组织的，不同培养及配方的出芽率和形态均有差别。外植体在6-BA＋IAA组合的培养基芽诱导率较MS＋6-BA＋NAA高一些（表2）。外植体在6-BA＋IAA 组合培养基里诱导的丛生芽呈现绿色，芽点较多，而6-BA＋NAA组合培养基里的外植体长出的丛生芽芽点较少，在茎段上长出一点一点白色蓬松的愈伤组织。故6-BA＋IAA更适合用于黄果西番莲茎段再生芽的诱导培养，以MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L中芽诱导率最高。

2.3 不同激素浓度对生根的影响

不定芽接种在生根培养基后，基部逐渐膨大并长出根原基，随后根毛逐渐伸长，形成根系良好的完整植株。黄果西番莲的不定芽在添加或无添加IBA 的培养基上均能生根，但在添加IBA 的培养基上生根效果较好，不同IBA浓度对生根诱导影响结果（表3），以MS＋IBA 0.5～1.0 mg/L培养基诱导生根最好。黄果西番莲茎段组培过程（图1）。

表2 不同激素浓度对西番莲茎段再生芽诱导的影响

表3 不同激素浓度对西番莲再生芽生根诱导的影响

3 讨论与结论

3.1 讨论

植物组织培养中，对田间取材的植物材料进行预处理很有必要，田间复杂的环境导致病虫害较多，且西番莲的匍匐茎是中空的，难以消毒干净。外植体消毒是组织培养繁殖方式最重要的环节之一，通常消毒剂对植物材料都具有毒害作用，且对环境的污染也比较严重［14]，因此选择适当的消毒剂种类和处理时间非常关键。李红艳［15]在不同灭菌剂对紫果西番莲茎段无菌芽诱导的影响进行研究，结果显示，双因子HgCl210 min＋NaClO 10 min是最佳的灭菌处理组合。本试验选取田间采集的一年生黄果西番莲健康茎段进行初步消毒、水培扦插后新生的幼嫩腋芽及茎段作为外植体，比直接从田间采集的幼嫩腋芽和茎段更少接触病虫害，在相同消毒处理下有助于降低污染率。此外，在提高消毒时间追求低污染率的同时还要兼顾未污染外植体的存活率方有实际意义。在本研究中对两者数据均作了统计，结果显示0.1%HgCl2消毒15 min，污染率为26.7%，未污染存活率为95.2%，为优化的消毒处理方法。

图1 黄果西番莲茎段组织培养

在前人对西番莲茎段组培的研究中，Costa等［9]研究发现，低浓度的细胞分裂素适合黄果西番莲茎段外植体芽的增殖和叶的发育，细胞分裂素和生长素不利于根系的分化和生长；杨冬业等［8]以西番莲茎段为外植体，在MS＋6-BA2.0mg/L上丛生芽诱导率达100%；史沉鱼等［16]认为，最佳丛生芽诱导培养基为MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋土豆泥200 mg/L；孙琪等［17]以西番莲当年生幼嫩茎段为材料在MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L IAA 中芽诱导率最高。本试验选用6-BA 和IAA、NAA 激素组合进行对比试验，结果为黄果西番莲幼嫩腋芽和茎段在MS＋6-BA＋IAA 组合的培养基上芽诱导效果较好，与孙琪等［17]研究结果相似。

生根培养方面，外源的生长素可以有效的刺激细胞的分裂和根原基的形成，促进生根诱导和伸长，组培中最常用的生根剂为IBA 和NAA。史沉鱼等［16]研究结果表明，紫果西番莲再生芽的最佳生根诱导培养基为MS+IBA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋活性炭2.0 g/L；Prithviraj 等［7]发现，黄果西番莲再生芽在1/2 MS＋IBA 0.5～1.0 mg/L 生根效果好，生根率达96%以上。本研究结果与Prithvi‐raj 等［7]研究结果一致。

3.2 结论

本试验以南美引进黄果西番莲一年生健康茎段经过预处理后水培扦插长出的腋芽和幼嫩茎段为外植体，对外植体的消毒试剂及时间、芽诱导培养基激素及浓度、生根培养基的激素浓度进行优化筛选。结果表明：经过预处理水培扦插后的外植体经过0.1%升汞处理15 min 后污染率最低且未污染成活率最高；外植体在MS＋6-BA 2.0 mg/L＋IAA 1.0 mg/L 上芽诱导率最高，为96.3%；不定芽在1/2 MS＋IBA 0.5～1.0 mg/L 培养基上生根效果最好，生根诱导率最高可达100%。

本研究获得了一套适宜南美引进黄果西番莲的组培快繁方法，可应用于母本资源保存和种苗繁育。