促红细胞生成素肝细胞激酶受体及其膜结合配体对牙槽骨改建作用的研究进展

王琳璇 王琦 赵云 米方林,2

1.川北医学院口腔医学系 南充 637000；2.川北医学院附属医院口腔科 南充 637000

促红细胞生成素肝细胞激酶受体及其膜结合配体（erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor and ephrin ligand，ephrin/Eph）通过细胞与细胞间短距离的信号传导，参与调节生长发育、促进疾病发生发展的各个过程，包括神经发育及再生、干细胞分化、肿瘤发展、细胞迁移、免疫功能以及骨组织重建等。研究ephrin/Eph与牙槽骨改建的机制，为加速正畸牙移动或控制牙周炎引起的牙槽骨吸收提供新的思路。通过对ephrin/Eph通路的研究，更清楚地了解其内部机制，为正畸治疗和牙周炎牙槽骨吸收控制提供新的方向，为加速正畸牙移动、控制炎症下牙槽骨的吸收提供可能。

1 ephrin/Eph的生理特性及其功能

1.1 ephrin/Eph的生理特性

Eph作为受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的最大家族，与其他RTK类似，可通过配体激活的激酶结构域将细胞外的信号传递至细胞内[1]。Eph家族也有其明显的特征，即通过与邻近细胞上的配体ephrin的相互作用来介导接触依赖的细胞间信号转导，而非通过结合可溶性的配体来实现这一过程。Eph受体是由1个N端胞外配体结合区、1个跨膜结构域和1个胞内激酶结构域构成的Ⅰ型跨膜蛋白[2]，胞外配体区的半球结构域和半胱氨酸富集区结构域负责与配体结合，而Ⅲ型纤连蛋白重复区域可以稳定Eph受体的二聚化，帮助完成细胞内信号的级联放大。Eph可依据序列的同源性和对应配体的亲和力分为A、B两类，EphA包括EphA1～A8、A10，EphB包括EphB1～B6。ephrin配体是锚定在细胞膜上的跨膜蛋白，依据是否借助糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定可分为ephrinA/ephrinB，即ephrinA1～A5/ephrinB1～ B3[3-4]。

1.2 ephrin/Eph的生物学功能

研究[5-6]表明，ephrin通常与相对应的Eph相互结合进而发挥生物学作用。但事实上，并非同一组的受体和配体以同等亲和力相互结合，也存在少数例外，如EphA4可以与ephrinA和ephrinB结合，ephrinA5可以与EphB2结合。Eph受体和ephrin配体二者可依赖细胞近距离的接触而活化，通过膜结合或抗体成簇2种方式相互激活而发挥作用。当Eph受体与ephrin配体近距离接触时，会发生方向相反的双向信号传导作用，以ephrin为配体向Eph表达细胞内传导信号（即依赖Eph激酶活性正向信号）的同时，也可作用于自身细胞发挥反馈调控作用（即依赖Src家族激酶及其效应分子的反向信号）[7-8]。提示ephrin/Eph可通过细胞突触介导非相邻细胞甚至是远处细胞之间的信号转导，但由于外功能区本身不能引发聚合链式反应，因此不太容易激活正向信号，这就为针对ephrin/Eph开发细胞间信号转导的拮抗剂提供可能[9-11]。目前已有研究证实，ephrin/Eph参与体内多种生命活动，通常介导相同或不同类型的接触依赖性信号转导，以控制细胞形态、黏附、运动、增殖、存活和分化。ephrin/Eph信号通路调节细胞黏附和运动的能力，使这个家族成为调节组织分离和形态发生的强大系统，该系统的失调与更具侵袭性和转移性的肿瘤的发生有关[12-13]。通过这些活动，ephrin/Eph在不同细胞群的空间分布、轴突的形成、突触连接的形成以及血管重塑中起着重要作用，此外，ephrin/Eph还可在上皮分化及其完整性、骨重塑、免疫功能、胰岛素分泌和干细胞自我更新等方面发挥调节作用[14]，有文献[15]报道促红细胞生成素对骨改建的促进作用也可能是通过ephrin/Eph信号通路。

2 在不同生理状态下，ephrin/Eph参与破骨细胞和成骨细胞的相互调控及其机制

骨改建的生物学过程是骨吸收和骨形成的动态平衡过程，需要依赖成骨和破骨细胞的偶联作用，即使外界环境发生改变，生理性的骨改建也会维持在相对平衡的水平[16-18]。由此可见，无论是正畸治疗中需要进行的牙移动，或是牙周炎治疗中需要阻断的牙槽骨吸收，均涉及牙槽骨的改建过程。骨愈合的过程由混合的炎症物质的释放开始，随后是肉芽组织的形成，最后是成骨细胞基质形成和成骨/破骨细胞相互作用的骨重塑[19]。

2.1 正常生理状态下，ephrin/Eph在破骨细胞及其前体细胞、成骨细胞中的表达及其作用

在正常生理状态下，成骨细胞与破骨细胞可相互影响。成骨细胞分泌的骨保护素（osteoprotegenin，OPG）、核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）等参与破骨细胞分化的调控，而破骨细胞分化的骨形态发生蛋白-6（bone morphogenetic protein-6，BMP-6）参与成骨过程。研究[20]表明，Eph家族及其配体参与的骨改建过程，能同时在成骨细胞与破骨细胞中表达，但特殊的是，在破骨细胞前体细胞分化过程中，只表达ephrinB1和ephrinB2。

在破骨细胞及其前体细胞中，ephrin/Eph双向信号的作用是复杂的，与目标组织的来源、细胞类型和骨生长发育阶段等不同状态相关。有研究[21]证实，ephrinB1与EphB2的相互作用，可以启动EphB2介导的正向信号以刺激前体细胞增殖，同时通过ephrinB1的反向信号促进成骨细胞的分化。早期有报道[22]称，破骨细胞中的ephrinB2与成骨细胞表达的EphB4之间相互作用有助于维持骨微环境的稳态。然而，有学者未能在实验中检测到破骨细胞的ephrinB2蛋白，或未能在凝血酶受体激活肽（thrombin receptor-activating peptide，TRAP）阳性的破骨细胞中发现EphB4受体，原因可能是晚期发育的骨或者成人骨存在特异性的ephrin/Eph膜蛋白脱落。此外，他们还发现，新形成的骨细胞表达高水平的ephrinB1及其同源的EphB2受体，western blot实验[4]也发现破骨细胞前体细胞中高表达EphA4。有研究[23]表明，ephrinB2/EphB4的作用机制是破骨细胞表达的活化T细胞核因子1蛋白（nuclear factor activated T1 protein，NFATC1）的靶基因ephrinB2与成骨细胞表面表达的EphB4受体相结合产生双向的信号传递，正向信号是通过刺激EphB4增强RhoA蛋白的活性而诱导成骨细胞分化，而逆向信号是通过NFATC1的靶基因ephrinB2将信息传入破骨细胞。但其参与骨改建的具体过程尚不明确，仍需进一步研究。

在成骨细胞中，ephrin/Eph双向信号的作用与破骨细胞不同。有实验表明，成骨细胞表达ephrinB2是受甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）及其相关蛋白表达的刺激。在使用sEphB4处理成骨细胞后，会特异性抑制EphB4/ephrinB2的磷酸化，降低骨钙素等分泌，同时增加RANKL的表达。在体内缺乏PTH时，sEphB4处理后会相应增加早期成骨标志Runt相关转录因子2（Runtrelated transcription factor 2，RUNX2）以及碱性磷酸酶等的表达，但其分化的晚期标志及成骨率并没有明显改变[22]。在成骨细胞分化的晚期，需要限制成骨细胞系的EphB4/ephrinB2信号，并进一步限制成骨、促进破骨。然而，sEphB4诱导RANKL的表达增加仅能在细胞培养的第2天观察到，提示其诱导的RANKL表达增加可能仅限于早期低分化的成骨细胞。

2.2 炎症或其他特殊状态下，ephrin/Eph在破骨细胞、成骨细胞及其前体细胞中的表达及其作用

在炎症或其他特殊环境下，ephrin/Eph信号通路在破骨细胞以及成骨细胞中表现出不同作用。Shen等[24]通过体外构建牙周炎微环境观察破骨细胞与成骨细胞ephrinB2/EphB4的表达量与成骨、破骨的相关性后发现，下调EphB4，骨形成受到抑制，成骨相关标记物的mRNA和蛋白质表达水平均下降，破骨细胞数量及标志物表达均升高；而ephrinB2的表达量下降后，各项指标均无明显变化，该研究者推测可能是由于ephrinB1或其他因子为其提供了代偿作用，由此可见，在炎症状态下EphB4对骨缺损的愈合有重要作用。Wu等[25]的实验发现，糖尿病患者伴骨质疏松的同时EphB4/ephrinB2信号通路相关因子表达降低，表明ephrin/Eph信号通路可能也参与了糖尿病患者牙周骨质破坏。EphB4/ephrinB2是否会成为牙周炎骨丧失治疗的新的靶点，仍然需要进一步研究。但有实验表明，PTH对成骨细胞分化的影响取决于ephrinB2是否有反向信号，而不是EphB4的正向信号，同时有实验表明胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）作用后ephrinB2的表达增加，因此不排除IGF-1对成骨细胞的作用也是通过ephrinB2的表达[26]。在Irie等[27]的研究中发现，成熟的成骨细胞和破骨细胞均表达EphA2，在RANKL的刺激下巨噬细胞也会表达ephrinA2，但当c-fos基因被敲除后，RANKL的诱导则会失败，而当NFATC1的活性被抑制后同样无法产生诱导效应，说明ephrinA2的表达需要依赖于c-fos和NFATC1。Gao等[28]的研究表明，在牙龈卟啉单胞菌作用下成骨细胞及破骨细胞EphA2表达量均升高，且成骨细胞与破骨细胞活性分别降低和升高。而Zhang等[29]的研究显示烟瘾卟啉单胞菌在成骨-破骨细胞共培养体系中对ephrinB2/EphB4信号通路有双向作用，证明在牙周炎骨吸收过程中ephrin/Eph通路有着重要作用。还有学者发现EphA4和EphA5也参与了骨改建。Yamada等[30]的研究表明，长期传代的骨髓基质干细胞能够抑制骨生成，EphA5在骨髓基质干细胞原代培养中低表达，但在培养后呈高表达，同时EphA5基因被敲除后碱性磷酸酶mRNA表达增高，但在人骨髓间充质干细胞中的过表达会降低碱性磷酸酶、RUNX2的mRNA的表达，该研究提示，EphA5将来可能成为骨髓间充质干细胞成骨分化能力的新的治疗靶点和质量控制指标。

ephrin/Eph家族在骨改建中的作用被提出后，已有大量文献报道，该通路是继RANKL/OPG通路后又一个影响骨改建的重要通路，而在口腔治疗中，无论是在调控正畸牙移动速度，或是控制牙周炎牙槽骨吸收，都离不开骨改建的过程。但是，ephrin/Eph通路是否会成为新的正畸或牙周治疗的靶点，还需进一步研究证实。

3 ephrin/Eph在牙周膜中的表达及其作用

牙周膜成纤维细胞是存在于牙槽骨与牙骨质2种骨化组织之间的结缔组织细胞，其不仅区别于身体其他部位的成纤维细胞，同时也区别于牙龈成纤维细胞。有实验在对牙龈成纤维细胞与牙周膜成纤维细胞进行对比检测时发现，ephrin/Eph在牙周膜成纤维细胞中高表达的同时，还能常规检出碱性磷酸酶以及强阳性的BMP，由此可见，ephrin/Eph同样参与牙周膜成纤维细胞的生物学调控过程[30-31]。

3.1 正畸力作用下，牙周膜成纤维细胞ephrin/Eph的差异性表达

在正畸治疗中，如何加快牙移动速度是正畸医生们迫切关注的问题。在适量正畸力的作用下，牙周组织发生改建，压力侧骨吸收，同时张力侧新骨形成。适当的正畸力通过牙周韧带传递到牙槽骨，而对机械力敏感的细胞，即牙周膜成纤维细胞能够将机械力转化为细胞信号。体外实验表明，拉力作用下牙周膜成纤维细胞的成骨基因，如RUNX2等基因表达上调，使牙周膜可通过ephrin/Eph通路调节牙槽骨改建。Diercke等[31]的研究发现，ephrin家族中，B1、B2、B3均可以在牙周膜中检测到，同时在加力后，ephrinB2表达上调而EphB4表达无明显变化，由此推测，ephrinB2在牙周膜成纤维细胞上的高表达不是与该细胞上的EphB4相互作用，而是可能通过ephrinB2与EphB4将机械力的作用从牙周膜成纤维细胞传递到邻近牙槽骨，并对牙槽骨骨改建进行调控；同时，ephrinB2与EphB4在成纤维细胞群中的相互作用也有可能影响牙周膜成纤维细胞的成骨作用，在压力作用下4或6 h后，牙周膜成纤维细胞中ephrinA2、EphA2表达升高，而ephrinB2、EphB4表达降低。有研究发现，ephrinA2在压力作用下表达于牙周膜成纤维细胞与c-fos通路和Ras依赖途径相关，ephrinA2可以刺激血清反应元件依赖的荧光素酶的活性，进而可能激活诱导c-fos，而且ephrinA2也被发现可以调节牙周膜成纤维细胞上ephrinA2的表达，因此，该研究人员认为牙移动可能可以通过药物干预[32-33]。Hou等[34]通过对大鼠模拟正畸加力模型后发现，加力侧牙周膜细胞及破骨细胞均表达ephrinB2，且较对照组表达量明显增加。杜沿林等[35]也通过对大鼠施加正畸力发现，正畸力施加1～3 d后，近中侧牙周组织ephrinA2表达量上升，因此猜测可能是成纤维细胞表达的ephrinA2和破骨细胞前体细胞上的EphA2结合，在短时间内促进大量破骨细胞形成相关，而ephrinA2在破骨细胞生成过程中又起到至关重要的作用。通过对ephrin/Eph信号通路的进一步研究，更全面地了解其内在机制，为开发调控成骨细胞和破骨细胞活性的药物提供有价值的信息，以更好地控制受压区的骨吸收来加速正畸牙的移动。

3.2 炎症状态下，牙周膜成纤维细胞中ephrin/Eph的差异性表达

Li等[36]通过体外模拟牙周炎环境，检测牙周膜成纤维细胞表达ephrin相关因子的状况，结果发现，在特定浓度的牙龈卟啉单胞菌脂多糖的作用下，牙周膜成纤维细胞ephrin/Eph的mRNA表达情况如下：EphB4在12和24 h均低于对照组，48 h后变化不明显；EphA2前24 h无变化，48 h显著增加；ephrinA2在12～24 h逐渐增加，48 h略下降，但依然明显高于对照组，而ephrinB2无明显变化；同时在该研究中还发现，RUNX2和骨钙素的表达量明显下降。由此可见，牙周膜成纤维细胞表达的ephrin/Eph可能也参与调控牙周炎状态下的牙槽骨吸收过程。通过对炎症状态下牙周膜成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞的相关基因表达的研究，为牙周炎牙槽骨吸收的控制寻找新的治疗靶点。

4 展望

正畸治疗中，矫治器和各种矫治方法不断更新，但正畸治疗时间依旧过长，这也是很多患者拒绝接受正畸治疗的原因之一。如何加快牙移动速度，是正畸医生及患者迫切希望得到解决的难题。在牙周炎患者最担心的问题是牙周炎导致的牙槽骨萎缩以及牙齿脱落。通过对ephrin/Eph通路的研究，能更清楚地了解其内部机制，是否可以为正畸治疗和牙周炎牙槽骨吸收控制提供新的方向，或是通过骨组织改建相关通路的阻断剂或激动剂等药物作用，加速正畸牙移动、控制炎症状况下的牙槽骨吸收。