牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡的研究进展

张智颖 刘东娟 潘亚萍

1.中国医科大学口腔医院牙周科 沈阳 110002；2.中国医科大学口腔医院综合急诊黏膜病科 沈阳 110002

外膜囊泡（outer membrane vesicle）是一种在革兰氏阴性菌及某些古细菌、革兰氏阳性菌等中普遍存在的包含生物学活性物质的球形双层纳米结构，其直径为50～250 nm[1]。外膜囊泡主要由外膜蛋白、脂多糖、磷脂、DNA以及在形成过程中被外膜包裹的一部分周质组成。外膜囊泡的蛋白质包括毒力相关因子以及一些运输蛋白，它的蛋白质组是动态的，特定的蛋白质包装到外膜囊泡，并根据生长条件的差异产生富集[2]。外膜囊泡有着重要的生物学功能，如向宿主细胞传递毒力因子，诱导宿主免疫应答，促进细菌生物膜的形成和维持生物膜的稳定，参与细菌应激反应等[3]。

近年来，外膜囊泡在细胞间的通讯和作为人类疾病的生物标志物方面的作用引起了广泛的关注，特别是外膜囊泡中所包含的微小RNA（small RNA，sRNA）。sRNA是一种基因表达调控因子，被认为是候选的种间通讯分子[4]。目前认为，外膜囊泡的生物发生主要包括以下几个方面：1）外膜囊泡可能是由细菌外膜被错误或过表达的包膜蛋白累积所产生的物理压力挤压而产生[5]。例如，DegP是HtrA家族的成员，低温下在革兰氏阴性菌的周质中作为伴侣发挥作用。野生型大肠埃希菌中的囊泡化水平的增加与DegP表达水平呈正相关。2）细菌外膜层与肽聚糖层连接的破坏可导致外膜囊泡的脱落。有研究[6]发现，外膜层与肽聚糖层连接相关蛋白的缺失会影响外膜囊泡的形成。例如在铜绿假单胞菌中，OprI是一种丰富的外膜蛋白，可与肽聚糖层发生共价作用。而OprI基因的缺失可显著增强铜绿假单胞菌的外膜囊泡形成。3）细菌外膜局部曲率的增加也可导致外膜囊泡形成。例如，假单胞菌喹诺酮信号（Pseudomonas quinolone signal，PQS）可通过与细菌外膜直接作用，导致外膜扩张、膜曲率增加，进而产生外膜囊泡[7]。

牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性杆菌，被认为是牙周疾病最重要的致病菌之一，与多种牙周疾病密切相关[8]。19世纪80年代Williams等[9]首次报道了牙龈卟啉单胞菌可产生外膜囊泡，但其生理功能和致病机制并不明确。与其他革兰氏阴性菌的外膜囊泡一样，牙龈卟啉单胞菌的外膜囊泡直径为50～250 nm。研究者[10]近期利用遗传学、蛋白质组学和形态学工具，发现牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可作为载体携带由其原菌产生的多种毒力因子，如黏附素和蛋白酶等。本文着重讨论牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡的特征及毒性功能，旨在为研究牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡提供参考。

1 牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡的形成及调控

牙龈卟啉单胞菌细胞表面存在外膜囊泡，并可将外膜囊泡释放到环境中[11]。牙龈卟啉单胞菌菌株都可检出外膜囊泡，但各菌株的囊泡化程度有所不同。根据菌毛主要亚单位FimA的基因型，可将牙龈卟啉单胞菌菌株分为Ⅰ、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等6种类型。Kerr等[12]通过透射电子显微镜比较牙龈卟啉单胞菌Ⅰ型（ATCC 33277）、Ⅲ型（ATCC 49417）和Ⅳ型（W83）菌株表面外膜囊泡的差异，发现ATCC 33277和ATCC 49417菌株表面外膜囊泡明显多于W83菌株。当将fimA基因插入与ATCC 33277菌株具有相同基因背景的W83菌株时，W83菌株出现与ATCC 33277菌株相似的外膜囊泡，提示菌毛亚单位参与了外膜囊泡的形成。此外，ATCC 33277菌株培养基中分离的外膜囊泡数量高于fimA突变菌株培养基中外膜囊泡的数量。无菌毛菌株W83的培养基中外膜囊泡数量较低。上述研究表明，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡的生成水平与菌株中f i mA的表达水平呈正相关。

此外，一些膜相关蛋白的缺失或过表达会影响许多革兰氏阴性菌的外膜囊泡的形成，这可能由膜结构改变或膜稳定性降低所造成[13]，如有研究[14]发现大肠埃希菌W3110中菌毛蛋白的合成是外膜囊泡产生的必要条件。

除了与FimA表达相关外，牙龈卟啉单胞菌的囊泡化还与外膜蛋白（outer membrane protein，Omp）A样蛋白Pgm6/7和半乳糖4-表位异构酶GalE的表达有关[15-16]。目前认为GalE能够催化尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖与UDP-半乳糖的相互转化。Nakao等[15]对牙龈卟啉单胞菌GalE突变株进行观察，发现无论是在突变株的表面，还是在培养基中，均未发现外膜囊泡。然而，在牙龈卟啉单胞菌OmpA突变株的表面和培养基中，外膜囊泡的数量明显多于野生型牙龈卟啉单胞菌组[16]。在沙门氏菌、霍乱弧菌和大肠埃希菌的OmpA突变株中也存在大量外膜囊泡[17]。虽然其机制尚未完全阐明，但OmpA似乎在维持细菌外膜的完整性和细胞壁更新中发挥重要作用。

2 牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡对宿主的影响

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡拥有其原菌的基本生物学特性，如诱导炎症反应、损伤宿主细胞及向宿主细胞传递毒力因子等[15,18]。研究[18]发现，采用较高浓度（＞3 μg·mL-1）的牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡处理口腔上皮细胞或牙龈成纤维细胞，可导致细胞黏附能力降低，细胞脱离培养皿底部；用低浓度（0.5 μg·mL-1）处理时，未见细胞脱离现象。采用高温处理或牙龈素抗体处理外膜囊泡后，外膜囊泡介导的细胞脱离现象消失，这说明该现象可能存在牙龈素依赖性宿主细胞损伤。

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡能够通过多种途径侵入宿主细胞。研究者[19]在外膜囊泡内鉴定出了几种与牙龈卟啉单胞菌附着和侵入宿主细胞有关的膜蛋白，包括FimA、血凝素A和热应激蛋白（HtrA）。因此，从牙龈卟啉单胞菌中提取的外膜囊泡也可以侵入人的口腔上皮细胞、牙龈成纤维细胞等[20-22]。与牙龈卟啉单胞菌ATCC33277高侵入能力一致，ATCC33277菌株的外膜囊泡侵入牙龈上皮细胞和成纤维细胞的能力也高于W83菌株的外膜囊泡[12]。然而，外膜囊泡侵入对宿主细胞的影响目前仍尚未研究清楚。研究者[20]发现，外膜囊泡的侵入可促使上皮细胞内转铁蛋白受体降解，从而导致细胞内转铁蛋白减少。丝氨酸磷酸酶SerB的分泌，可使肌动蛋白解聚因子/cofilin的Ser3残基去磷酸化，可能是牙龈卟啉单胞菌侵入宿主细胞的一个关键步骤[22]。然而，在牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡中未发现SerB[23]。因此，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可能利用了不同的上皮细胞内化机制。牙龈卟啉单胞菌还可以通过肌动蛋白介导的膜突起或循环内吞途径从一个细胞侵入另一个细胞[24]。因此有研究者[25]推测，侵入细胞内的外膜囊泡也可以从一个细胞侵入另一个细胞。但Furuta等[21]却认为，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡通过内吞途径内化后，最终进入溶酶体。

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可以诱导宿主的炎症反应，在一定条件下也可调控机体免疫反应，且具有更强的免疫原性，在慢性牙周炎发生、发展过程中发挥重要作用[26]。利用小鼠鼻内接种免疫模型进行研究，发现牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡在初始免疫后5周，有效地诱导了牙龈卟啉单胞菌特异性血清免疫球蛋白（immune globulin，Ig）G和IgA以及唾液IgA，然而其原菌并不能产生这种效果，表明牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡较其原菌具有更强的免疫原性[15]。Kou等[27]发现永生化人牙龈上皮细胞与牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡共培养后，炎症相关因子环氧化酶（cycloxygenase，COX）-2、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1以及MMP-3的表达水平升高。研究[28-29]发现，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可通过扰乱上皮屏障和血脑屏障到达脑部，而存在于外膜囊泡中的脂多糖、牙龈素、菌毛等病原体相关分子模式有可能通过Toll样受体（Toll like receptor，TLR）2/4激活促炎信号通路，从而促进抗原呈递细胞分泌促炎因子肿瘤坏死因子-α、IL-1、IL-6及IL-8。这些研究表明，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可通过局部和全身途径诱发机体的炎症反应。此外，有研究[30]发现，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡似乎可以抑制γ-干扰素诱导的免疫反应，促使牙龈卟啉单胞菌逃避免疫监视。同时，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡对宿主单核细胞和巨噬细胞有明显的免疫调节作用，影响宿主炎症反应[26,31]。研究[32]证实，牙龈卟啉单胞菌的外膜囊泡可作为载体，将菌体内的sRNA转运到宿主细胞内，并有可能影响宿主免疫相关基因的表达和稳定，影响宿主的免疫应答。

牙龈卟啉单胞菌除了在牙周炎中发挥重要作用外，还与动脉粥样硬化、阿尔兹海默症[28]、类风湿性关节炎[33]和病毒传播[34]等生物学过程相关。根据外膜囊泡的生物学特性，推测其可能与这些生物学过程相关。现有研究[35]表明，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可通过ERK1/2-RUNX2促进血管平滑肌细胞钙化。牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡来源的脂多糖能够激活胶质细胞，诱发脑部炎症，并与阿尔兹海默症标志性蛋白Aβ和神经原纤维缠结的表达相关[28]。牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可以保护A-脂多糖修饰的PPAD蛋白免受水解，进而介导宿主蛋白瓜氨酸化，这可能诱导宿主抗瓜氨酸化蛋白抗体的产生，并产生耐受，诱发类风湿性关节炎[33]。此外，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡还可能作为载体促进人体免疫缺损病毒通过黏膜屏障进行病毒传播[36]。

3 牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡介导的菌间相互作用

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可将其他细菌引入牙菌斑，在促进牙菌斑的微生物多样性方面起重要作用。牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡不仅可以介导两种细菌的共聚，是两者之间的纽带，还可以增强某些细菌对上皮细胞的附着和侵入。牙龈卟啉单胞菌的外膜囊泡中存在所有的原菌黏附分子，如原纤维蛋白、牙龈素和血凝素，可调节多种口腔细菌的共聚，且其作用效果强于原菌[37]。例如，金黄色葡萄球菌常定植于鼻腔和咽部，只有经过牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡处理后，金黄色葡萄球菌才能够与口腔主要微生物如链球菌、放线菌以及白假丝酵母等发生共聚[38]。牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡还可介导齿垢密螺旋体和沙门氏菌的共聚，在不存在牙龈卟啉单胞菌或者在其外膜囊泡经过热处理的情况下共聚过程并不发生[39]。此外，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡可以增强福赛斯坦纳菌对上皮细胞的附着和侵入能力，且外膜囊泡的作用效果明显强于其原菌[40]，可能的机制是外膜囊泡中富集将福赛斯坦纳菌引入牙菌斑的某些黏附分子。

4 结论与展望

牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡拥有原牙龈卟啉单胞菌的主要生物学特性，这可能是牙龈卟啉单胞菌在口腔内得以生存的重要原因。此外，牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡含有原菌的毒力因子，且拥有比其原菌更强的免疫原性及侵入能力，使其在牙周炎的发生、发展及牙周炎相关的系统性疾病中发挥着比其原菌更强的致病作用。因此，调控或阻断牙龈卟啉单胞菌以及其他牙周病相关的口腔病原体外膜囊泡的形成，可能成为降低细菌毒力的治疗靶点之一。