表面增强拉曼光谱在肿瘤实验室诊断中的应用

张晨曦，孙 波，刘佳佳，刘书筠，张文丽，高 明，王亚东， 高 阳，吕 虹，张国军，2，樊瑜波 综述，康熙雄，2，△ 审校

(1.首都医科大学附属北京天坛医院检验科，北京100071；2.北京市免疫试剂临床工程技术研究中心，北京 100050；3.北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京 100191)

目前癌症仍然是世界各地所面临的重大挑战，迫切需要开发用于癌症早期筛查、诊断和术中手术指导的新技术。拉曼光谱作为一种新型分子光谱，检测生物样本时具有免标、不间断、原位检测等多种优势，近几十年里，该技术在生物学领域中的应用日益增加[1]。拉曼光谱是1928年印度物理学家RAMAN发现的一种非弹性散射光谱，它用于研究分子的振动，能根据分子的转动能级或振动能级确定分子结构，是一种振动的分子指纹光谱[2]。拉曼光谱作为一种分子指纹光谱，检测样品具有分析速度快、操作简单、使用范围广、抗干扰能力强等明显的优势[3]。

表面增强拉曼光谱(SERS)是指将待测物分子吸附在粗糙的纳米金属材料表面，由于拉曼的信号较弱，SERS技术可使待测物的拉曼信号增强106～1 015倍，解决了普通拉曼光谱灵敏度低的问题[4]。生物体系中与代谢相关的信息主要通过蛋白质、核酸、脂类等生物分子的含量、种类以及结构的变化来体现，近几年SERS技术在肿瘤检测方面得到初步发展，原因是癌变的血清中的各个成分会发生微小变化，一般方法很难检测到，而利用SERS技术能够检测肿瘤血清及其组织中分子结构、构象的微小变化；由于生物样本信号的荧光背景干扰比较大，SERS技术可以减弱甚至避免相应的荧光背景干扰，因此根据表面增强拉曼光谱的改变可以对肿瘤进行早期筛查、诊断以及指导治疗[5-6]。与传统免疫学、电化学等检测技术相比，SERS技术的主要优点是直接分析、无标记检测、操作简单；同时避免了传统方法中抗体应用，特别是单克隆抗体高花费等的问题[7-8]。

1 表面增强拉曼光谱在肿瘤血清标本中的应用

利用SERS技术分析人体血清SERS，可对血清内含有的各种生物分子的性质是否发生改变有更深层次的了解，从而判断身体功能变化。目前文献报道，利用SERS技术可以检测肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、腮腺肿瘤、前列腺癌等血清标本，从而实现疾病的快速筛查、诊断[9]。

1.1肝癌 SHAO等[10]研究探索了一种快速无损的肝脏疾病检测技术-SERS技术，实现肝脏疾病的早期诊断、预防和治疗。此实验测试304例健康者，333例肝病患者(48例慢性乙型肝炎、49例代偿性肝硬化、48例失代偿期肝硬化、46例0期肝细胞癌、46例1期肝细胞癌、49例2期肝细胞癌、47例3期肝细胞癌)和99名食管癌患者的血清标本，分别从以下方面进行谱图比较：(1)对比健康者、肝病组、食管癌组发现：在724、958、1 326和1 655 cm-1位移处，患病组峰高低于对照组，在638、811、888、1 021、1 132和1 218 cm-1位移处，患病组峰高高于对照组，除1 655 cm-1位移处，差异均具有统计学意义(P<0.05)；(2)对比慢性肝病组(慢性乙型肝炎、肝硬化代偿期、肝硬化失代偿期)与肝细胞癌组发现：在位移1 218、1 339、1 438和1 580 cm-1位移处，慢性肝病组峰高更明显，在位移811和1 021 cm-1处，肝细胞癌组峰高最明显，除1 438 cm-1外，所有峰均显示差异有统计学意义(P<0.05)；(3)对比慢性乙型肝炎、肝硬化代偿期、肝硬化失代偿这3组发现：在638、681、809、1 068、1 218、1 350、1 444和1 661 cm-1位移处，除1 218 cm-1，差异均有统计学意义(P<0.05)；(4)对比不同分期的肝细胞癌组发现：在位移684、743、1 021、1 219、1 339、1 441、1 659 cm-1位移处，除1 219和1 441 cm-1，差异均有统计学意义(P<0.05)。在这项研究中，通过检测血清的SERS信号并结合偏最小二乘法-线性判别分析(OPLS-DA)进行光谱分析，结果表明该方法对肝病的分类具有准确率较高、灵敏度好、检测快速等特点。因此，利用SERS技术联合OPLS-DA是一种肝脏疾病诊断的快速且非侵入性的新技术。

邵丽婷等[11]通过比较30例健康者与48例慢性乙肝、48例肝硬变和46例肝癌患者血清之间的拉曼光谱差异，结果表明健康者与3组肝病患者血清在位移625、725、806、947、1 018、1 219、1 131、1 329、1 440、1 580和1 660 cm-1处均有拉曼峰，且峰强弱存在差异；健康者血清在位移1 096和1 395 cm-1处有强峰，肝病患者血清在位移887 cm-1有强峰。受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)分别为0.981、0.966、0.984，结果表明基于OPLS-DA的血清SERS分类方法可作为肝病早期诊断分类的一种便捷辅助手段。

1.2乳腺癌 有很多研究报道利用SERS技术诊断乳腺癌，VARGAS-OBIETA等[12]测试了12例早期乳腺癌患者和15例健康对照者的血清，通过光谱分析，乳腺癌和对照者之间的主要差异是癌症谱中622(苯丙氨酸)、642(酪氨酸)、695、714(多糖)、742(脂质)、754、875(色氨酸)和1 083(磷脂)cm-1位移处的强度增加以及在1 002(苯丙氨酸)、1 155(β胡萝卜素)、1 328(色氨酸)和1 556(色氨酸)cm-1位移处的强度下降。这表明，与健康对照者相比，乳腺癌患者血清中某些生物分子的总SERS活性成分的百分比有所增加或减少；并结合主成分分析-线性判别分析(PCA-LDA)分类方法，区分乳腺癌与健康者的灵敏度和特异度分别为96%和87%；初步结果表明，SERS技术和PCA-LDA联用可用于区分对照组和癌症组，并且具有高灵敏度和特异度。

1.3口腔细胞癌 TAN等[13]研究了基于金纳米粒子的血清表面增强拉曼光谱用于口腔鳞状细胞癌的诊断，此实验选取135例口腔鳞状细胞癌患者、90例粘液表皮样癌患者和145例健康对照者，通过实验分析得出：与健康对照组相比，口腔鳞状细胞癌组在位移294、446、548、726、745、1 136、1 263、1 371、1 445和1 491 cm-1，峰高增加，在位移1 542和1 602 cm-1，峰高降低；与黏液表皮样癌组相比，口腔鳞状细胞癌组在位移294、1 139、1 263和1 491 cm-1处峰高增加，在位移1 602 cm-1处峰高降低；并结合PCA-LDA结果显示，口腔鳞状细胞癌可以成功地与健康对照组进行区分，灵敏度为80.7%，特异度为84.1%。交叉验证的过程证明PCA-LDA分析的结果是可靠的。

1.4前列腺癌 CHEN等[14]利用SERS技术实现前列腺癌与良性前列腺增生(前列腺特异性抗原浓度为4～10 ng/mL)的区分。本实验选取40例前列腺癌与40例良性前列腺增生的患者血清，前列腺癌组在位移637、808和1 655 cm-1处有更高的峰强度，而在位移492、727、743、960、1 314、1 208、1 326、1 445、1 537 cm-1处显示出更低的峰强度，表明这些差异可能会实现二者的区分，同时结合主成分分析和线性判别分析诊断算法，最终得出结论，SERS技术可能是一种很有前途的临床工具，用于提高前列腺特异性抗原浓度处于灰色区域的某些前列腺癌患者的活检阳性率。

p53是一种强大的转录因子，在预防癌症发展和保持基因组完整性过程中发挥着关键作用。在许多肿瘤中，发现该抑制剂基因突变后出现功能失活。因此检测p53在癌症的诊断及治疗过程中有着重要的意义[15]。BIZZARRI等[16]利用SERS技术联合免疫技术，通过检测患者血清，实现p53野生型与突变型的区分，表明该技术为肿瘤的早期诊断提供一种新型检测方法。

2 表面增强拉曼光谱在肿瘤组织标本中的应用

SERS技术在研究癌症细胞中也有一定的应用，肿瘤组织与正常组织的差异主要表现在细胞水平，包括与正常组织细胞在结构、形态和细胞行为方面存在不同程度上的差异。拉曼光谱作为一种新型的无创检测方法，可以反映正常组织到癌变的恶性转化过程中的生化组成和结构的改变，不但可以避免组织活检给患者带来的痛苦与负担,而且可以弥补常规检测方式中存在的不足[17]，通过对比正常与异常组织的特征光谱，从而鉴别正常与异常组织，在肿瘤的诊断上有一定应用价值。

2.1肺癌 佟倜等[18]利用SERS技术检测肺腺癌组织与正常组织，结果表明癌变组织具有比癌旁正常组织更强的拉曼信号峰,并且分析了位于1 250、1 344、408、1 568、1 608和2 560 cm-1附近的拉曼峰分别与蛋白质的Amide Ⅱ氨基化合物、C-H弯曲振动、核酸中CH3的对称变角振动、蛋白质色氨酸惰性环振动、蛋白质酰胺I谱带分子间反平行β-折叠的C-O健伸缩振动和蛋白质的巯基(S-H)伸缩振动有关，2 936 cm-1附近的拉曼峰为蛋白质CH2的对称伸缩振动和CH3的反对称伸缩振动共同作用产生。通过此实验表明，Au/Cu NRs能够作为基底应用于癌组织的SERS检测，从而在分子水平上区分正常组织和癌变组织，为病理学诊断提供一定参考。

2.2胃癌 巩龙静[19]利用SERS技术检测胃癌组织与正常组织，结果表明相比于正常组织，癌组织在724、1 329、1 367和1 597 cm-1处峰强度较高，在828和1 002 cm-1处峰强度较低；通过分析，癌组织中大部分蛋白质、糖类及脂类含量较低，核酸含量较高，这是由于癌细胞的新陈代谢较正常细胞活跃，导致大部分的蛋白质、脂类及提供能量的糖类消耗较大，难以在组织和细胞中聚集，因而在癌组织中含量较低。并通过此实验证明了胃组织的SERS信号比普通拉曼信号有明显的增强。这就体现出SERS作为拉曼光谱衍生技术，继承其优点的同时，还具有高灵敏度、高特异性等优点[3]。

2.3脑胶质瘤 UCKERMANN等[20]利用拉曼光谱检测人类脑胶质瘤中的IDH1突变诱导的化学改变，拉曼光谱分析显示IDH1突变型脑胶质瘤中与DNA相关的光谱带强度增加，归属于蛋白质的拉曼条带的强度在IDH1突变型和IDH1野生型脑胶质瘤中有所不同，此外，分配到脂质分子的光谱带亦显著减少。而且通过选择5条光谱带(498、826、1 003、1 174和1 337 cm-1)，实现了利用拉曼光谱对IDH1基因型进行分类，正确率为89%。

3 表面增强拉曼光谱在其他实验室标本检测中的应用

3.1尿液与前列腺癌 DEL MISTRO等[21]利用尿液的表面增强拉曼光谱，对健康者与前列腺癌患者的尿液进行了初探。此实验收集9例接受根治性前列腺切除术的前列腺癌患者[年龄(56±4)岁]与9例健康受试者[年龄(64±5)岁]的尿液标本，联合使用PCA发现前列腺癌组和对照组的SERS光谱之间的光谱差异，利用光谱数据的主成分分析和线性判别分析建立一种分类模型，最终区分前列腺癌患者与健康对照组的灵敏度为100%，特异度为89%，整体诊断准确率为95%。结合已有文献得知在拉曼位移721、958、1 084和1 461 cm-1处的峰全部归属于次黄嘌呤，而通过此次SERS分析，得到这种代谢物在前列腺癌样品中比健康对照组中更丰富[22-23]。即使考虑到本报告中涉及的样本数量非常有限，此方法的初步结果亦表明利用SERS技术检测尿液来诊断疾病也是非常有前景的。

3.2唾液与肺癌 QIAN等[24]等研究了61例肺癌患者和66例健康对照者的唾液样本，结果显示肺癌患者的峰谱高度低于健康者，且二者之间差异有统计学意义(P<0.05)，同时分析了肿瘤相关的12个特征峰。统计分析分类时使用支持向量机和随机森林算法，基于支持向量机的留一法交叉验证的灵敏度为95.08%，特异度为100%。随机森林法的灵敏度为96.72%，特异度是100%。此结果证明SERS技术对肺癌检测有潜在应用价值。

3.3细胞裂解产物与肿瘤分类 HASSOUN等[25]通过SERS技术检测细胞裂解物从而实现肿瘤的分类，该实验检测了Capan-1、HepG2、Sk-Hep1和MCF-7 4株细胞系，建立相应的分类方法以及后期交叉验证，模型的灵敏度、特异度和准确度均超过96%，通过此研究证明了该技术在细胞鉴定中的应用前景。

此外，亦有研究表明，通过SERE技术联合亲和层析方法检测尿液里的修饰核苷，以无创检测手段实现了鼻咽癌患者、食道癌患者与健康志愿者的区分，应用偏最小二乘和线性判别分析(PLS-DA)，其诊断的灵敏度分别为95.2%、90.9%和98.1%，特异度分别为97.2 %、98.2%和95.7%；这些结果证明了这种新方法在非侵入性和无标记癌症筛选、检测方面的巨大潜力[26]。

4 小结与展望

拉曼光谱作为一种分子指纹光谱，检测样品具有操作简单、检测速度快、检测范围广等明显的优势。SERS作为其衍生技术，继承其优点的同时，还具有高灵敏度、高特异度等优点，在今后医学诊疗应用中大有前景。通过查阅相关文献可知，不管是利用SERS技术检测体液标本或是组织标本，均可以实现快速、精准检测，为临床初筛、诊断、治疗争取最佳时机。但该检测方法亦受到很多限制，比如背景信号干扰、临床应用不成熟、表面增强的基底比如金、银纳米溶胶的制备及应用等，但结合其优势及后期研发、改进措施，该技术有望成为新型医学检测技术。