家蚕微孢子虫分子生物学研究进展

龚美霞，浦月霞，莫炳巧，冉艳萍，李枫烨

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市530007）

微孢子虫（Microsporidia）是一类能形成孢子的专营细胞寄生生物，寄主范围广泛，从无脊椎动物到脊椎动物，都能被其感染，曾经被认为是原生动物，但现在被划分为真菌界［1-2］。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，Nb）是引起家蚕微粒子病的病原，也是第一个被鉴定的微孢子虫。家蚕微孢子虫对家蚕的侵染潜伏期长，传播范围广，不仅能通过食下传染，而且能寄生于蚕幼虫、蛹和蛾，并通过蚕卵传染至下一代，给养蚕业造成的损失重大，严重影响蚕桑产业的稳定发展。因此，家蚕微孢子虫被列为蚕种生产的唯一检疫对象。研究者对家蚕微孢子虫的诊断技术［3］和家蚕微粒子病的防控技术［4-5］的研究较为充分，随着家蚕微孢子虫全基因组序列测序的完成，家蚕微孢子虫的研究进展迅速，尤其是家蚕微孢子虫蛋白质组学的研究，使人们对家蚕微孢子虫侵染相关蛋白有了一定的了解。本文从家蚕微孢子虫的分子生物学检测、基因序列分析、侵染相关基因等方面进行论述，为家蚕微孢子虫分子生物学检测技术的进一步发展奠定基础，同时为家蚕微孢子虫不同功能基因的挖掘提供科学依据，为进一步阐明家蚕微孢子虫与宿主家蚕的侵染机制提供理论基础。

1 家蚕微孢子虫分子生物学检测方法研究进展

1.1 核酸分子杂交检测法

核酸分子杂交检测法的基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链的高度特异性杂交。邱宝利等［6-7］用核酸杂交检测技术，以1对Nb特异引物合成的地高辛（DIG）为探针，把带毒蚕蛾和蚕卵从11种病原性微孢子虫中鉴定出来。韦亚东等［8］采用原位杂交技术，在感染家蚕微孢子虫的单粒卵内和幼虫中均检测到家蚕微孢子虫，并且该方法还可以用于感染家蚕微孢子虫蚕卵和幼虫体的早期诊断。但利用核酸分子杂交检测技术检测家蚕微孢子虫存在操作难度大、耗时和对仪器有一定要求等不足，一定程度上限制了该方法的研究与应用。

1.2 PCR检测方法

聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外模拟自然DNA复制过程的特定DNA序列扩增技术，在数小时内可将靶DNA扩增至百万倍。采用普通PCR法检测家蚕微孢子虫时，以家蚕微孢子虫的16s-rDNA序列［9］、rRNA基因序列［10］、核糖体小亚单位RNA（SSU rRNA）基因序列［11-12］和基因组DNA序列［13］来设计特异性引物，均能检出家蚕微孢子虫。蔡平钟等［13］以家蚕微孢子虫基因组DNA序列设计的引物对NbDNA的检测灵敏度达1 ng水平。刘吉平等［14］以Nb孢子SSU rRNA的保守区域设计的引物，对Nb纯孢子DNA模板和模拟染毒Nb孢子的蚕蛾DNA模板的检测敏感度分别达到3×104个/mL和3×105个/mL。HATAKEYAMA等［15］建立了一种可以检测家蚕卵微孢子虫的多引物PCR法。为了进一步提高PCR方法检测家蚕微粒子病的灵敏性与准确性，何永强等［16］比较了普通PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫的灵敏度，认为利用TaqMan探针荧光定量PCR检测方法和SYBR Green荧光定量PCR检测方法检测家蚕微孢子虫发芽液的灵敏度相近，均优于普通PCR，并建立了家蚕微孢子虫TaqMan探针荧光定量PCR检测方法及开发了相应的诊断试剂盒，该方法检测家蚕微孢子虫的特异性高，敏感度达1×102个/mL［17］。也有研究基于SYBR Green荧光定量PCR建立柞蚕微孢子虫检测方法［18］。扈鸿霞等［19］以微孢子虫 SSU rRNA基因的保守序列为靶标，建立了一种用于检测蝗虫微孢子虫的套式PCR，检测的微孢子虫数量达1.22×104个/mL，该方法具有灵敏、快捷、特异性强等特点。基于PCR的家蚕微孢子虫检测虽然具有灵敏度高、特异性强的优势，但是要求的技术相对较高，单次检验的数量少，现多用于实验室研究，暂时未适应和满足大生产的要求。

1.3 环介导等温扩增技术检测方法

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者近年来建立的一种新型核酸体外等温扩增技术［20］，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63℃左右）保温30～60 min，即可完成核酸扩增反应。经过多年的研究与技术提升，已广泛应用于病原微生物的检测［10，21-22］。近年来，LAMP技术在家蚕微孢子虫检测的研究也取得了很大的进展。YAN等［23］把FTA cards和LAMP技术结合，对家蚕微孢子虫的最低检测极限为10个孢子/mL，该方法用于感染家蚕微粒子病的早期诊断时间比常规的显微镜检测提早24 h左右。刘吉平等［24］以多种家蚕病原微孢子虫16S rDNA的保守序列为特异性引物，建立了一种能够有效检测多种昆虫微孢子虫LAMP检测方法和可视化快速检测试剂盒，能够检测到浓度为103个/mL的微孢子虫。为了快速有效地检出蚕卵微粒子病，刘吉平［25-26］以家蚕微孢子虫孢子繁殖复制相关的EB1基因为靶基因，建立了一种检测蚕卵感染家蚕微粒子病的LAMP检测方法，并且该方法对家蚕微孢子虫孢子DNA和EB1-pMDTM19-T质粒标准品的检测灵敏度分别为5.0×10-3ng/µL和1.0×102copies/µL，能检测人工感染Nb家蚕单个母蛾产卵的1/8卵圈量或1粒蚕卵。XIE等［27］研究者把LMAP技术与电化学方法结合，通过追踪LAMP扩增中生成的Pi，实现了基于LAMP技术检测家蚕微孢子虫的定性和定量研究，该检测方法对目标基因组DNA的定量检测极限是1.7×10-5ng/µL，检测的灵敏度大大高于单一LAMP技术的灵敏度。基于LAMP的诊断技术因其灵敏度高、肉眼可视和操作的可行性，研究者不仅开发了商用试剂盒用于实验室的精确诊断研究，还有望开发用于生产上的大批量诊断。

2 家蚕微孢子虫基因序列鉴定的研究进展

2.1 家蚕微孢子虫RNA序列的测序分析

2.1.1 家蚕微孢子虫的SSUrRNA的测序分析 微孢子虫类是唯一带有原核生物型核糖体的真核生物［28］，其核糖体是包含50 S和30 S大小两个亚基的70 S型核糖体，其中小亚基中的rRNA为16S rRNA，它被称为小亚基核糖体RNA（small subunit ribosomal RNA，SSUrRNA）。研究者最先用脉冲场凝胶电泳中分离出一条rRNA条带，并用Southern杂交方法证实了家蚕微孢子虫的SSU rRNA基因位于760 kb的一条染色体上［29］，随后王见杨等［30］克隆获得了SSUrRNA的全基因序列，全序列长1 233 bp。

2.1.2 家蚕微孢子虫小RNAs的测序分析 小RNAs根据不同的生物合成机制，小RNAs可以分成3个不同 的类别：microRNAs（miRNAs），小干涉 RNA（siRNA）和 PIWI-interacting RNAs（piRNAs）［31］。许金山教授研究室于2013年完成了对家蚕微孢子虫小RNAs的全基因组鉴定与分析，拟在鉴定与转座子相关的小RNAs和潜在的miRNAs［32］。家蚕微孢子虫小RNAs的长度多数为24 nt和25 nt，其中大部分序列表现出5＇末端的尿嘧啶（U）偏好性。通过与家蚕微孢子虫数据库配对，家蚕微孢子虫中有661 609个小RNAs，其中，75.93%小RNAs序列为基因组非编码区序列，21.68%为基因组重复序列，蛋白编码序列、tRNA和rDNA分别占1.73%、0.65%和0.01%。鉴定获得了31个候选miRNAs，其中有19个miRNAs为Nosema属的其他孢子虫所共有，暗示其在微孢子虫基因组进化上具有保守性［32］。

2.2 家蚕微孢子虫基因组测序分析

基因组（genome）是指一个生物体DNA（某些病毒RNA）中所包含的所有遗传信息，其中包括基因编码区和非编码区。早期的研究中，研究者利用脉冲场凝胶电泳从家蚕微孢子虫染色体DNA中获得18个条带，条带大小在380～1 500 kbp之间，DNA总长度约15.3 Mb［29］。2013年，西南大学周泽扬研究团队完成了家蚕微孢子虫CQ1分离株的全基因组测序［33］。家蚕微孢子虫有18条染色体，由3 551个重叠群构成1 605个scaffolds；基因组大小为15.7 Mb，共鉴定了4 458个基因，平均每个基因序列长度为741 bp；基因组中含有942对重复序列，占基因组总长45.2%，GC含量为30.7%。40%的基因具有注释功能，157个基因预测有内含子［33］。家蚕微孢子虫全基因组测序的完成，不仅为研究其基因功能和发掘新基因提供数据基础，大大加快微粒子病的诊断和防控研究，也将进一步推动微孢子虫分子生物学的深入研究。

2.3 家蚕微孢子虫转录组测序分析

转录组（transcriptome）是指特定细胞群在某一功能状态下所转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非编码RNA。转录组的研究可以通过基因芯片、cDNA文库和新一代的转录组测序等技术来进行。通过对家蚕微孢子虫转录组数据的分析，可以获得基因表达信息、基因序列和结构信息。

2.3.1 家蚕微孢子虫EST序列的测定 构建cDNA文库并进行表达序列表标签（expressed sequence tag，EST）测序，不仅可以获得基因组中具有重要功能的基因，而且能够反映出某个组织或个体在特定时期的基因表达丰度。李田等［34］对感染家蚕微孢子虫第10 d的家蚕幼虫构建Nb和家蚕丝腺混合样品的cDNA文库并测序，共获得EST序列5 026条，拼接后分别获得的Nb和丝腺的单一EST为383和563条。在此时期，Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因和Nb SWP蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等可能与Nb感染或寄生适应相关的基因的表达水平都较高。

2.3.2 家蚕微孢子虫高通量转录组测序 新一代高通量测序技术，能够全面快速地获得某一物种特定细胞、组织或器官在某一状态下几乎所有的转录本序列，转录组数据的获得为加快基因功能和结构的研究奠定了基础。刘吉平课题组采用RNA-Seq测序技术对家蚕微孢子虫进行了转录组测序，家蚕微孢子虫转录组的GC含量约为30%，共获得2 903条基因序列，其中已被注释的基因有1 414个，未被注释的序列有1 489条，另外还有未能组装成功的基因序列200条［35］。从预测的基因中选择一些功能基因如孢壁蛋白（HSWP）基因、极丝蛋白（PTP）基因、热激蛋白（HSP）基因等进行PCR扩增及测序验证，测序结果与预测基因序列的一致性均达到98%以上，说明转录组测序分析结果是可靠的［35-36］。LIU等［37］对家蚕微孢子虫休眠孢子（Nongerminated spore，NGS）和发芽孢子（Germinated spore，GS）进行了转录组学测序并分别获得2 756和2 690个鉴定基因。差异表达分析共获得66个显著差异基因，其中显著上调基因9个，包括蛋白磷酸酶PP2-A调节亚基；显著下调基因57个，主要包括糖代谢相关基因、SWP及RBL等。KEGG分析结果显示显著差异基因主要富集在戊糖磷酸途径和氨基糖核糖代谢途径。

3 家蚕微孢子虫侵染相关基因的研究

3.1 极管蛋白（polar tube protein，PTP）的研究

极管是微孢子虫特有的侵染结构。极管蛋白是组装极管的重要成分，特异定位于微孢子虫极管上。研究微孢子虫极管的蛋白组成，对于掌握极管这一特殊侵染装置的结构及其在侵染宿主细胞过程中所起的作用方面有着非常重要的意义。家蚕微孢子虫中已鉴定的极管蛋白主要有3个，NbPTP1、NbPTP2和NbPTP3［38］。吴玉娇等［39］在原核表达系统中成功表达重组NbPTP1蛋白并验证其能准确定位于家蚕微孢子虫的极管上。研究发现家蚕微孢子虫的3种极管蛋白能相互作用，但微孢子虫极管发芽机制以及极管与宿主细胞间的互作关系尚不明确。此外，在蝗虫（Antonospora locustae）微孢子虫中，发现2个与AlPTP2相关的极管蛋白AlPTP2b和 AlPTP2c［40］，在其他微孢子虫中还鉴定出PTP4和PTP5［41-42］。

3.2 孢壁蛋白（spore wall protein，SWP）的研究

微孢子虫的孢壁是孢子最外层的结构，是最先、最直接与宿主接触的部位，其主要组成成分是孢壁蛋白。对孢壁蛋白进行分离鉴定，研究其生物学功能，对于阐明微孢子虫侵染机制以及与宿主之间的关系非常重要。目前，已发现并报道的家蚕微孢子虫孢壁蛋白主要有SWP30、SWP32、SWP25、SWP26、SWP5、SWP11、SWP12和 SWP16、SWP7和 SWP9。SWP32和SWP25可能与家蚕微孢子虫发芽有关［43］，SWP25互作蛋白的筛选实验，认为在家蚕微孢子虫入侵时起到作用并与孢壁蛋白SWP25具有互作作用的是家蚕硫氧还蛋白过氧化物酶（BmTpx）和家蚕蛋白激酶C受体1（BmRACKA）［44］；SWP26肝素结合基序是家蚕微孢子虫对宿主细胞粘附作用的关键结构域［45］，此外，SWP26与家蚕类海龟蛋白（Bombyx moriturtle-like protein，BmTLP）之间存在相互作用［46］。NbSWP16蛋白可能与家蚕微孢子虫的孢壁蛋白NbSWP1、NbSWP3、NbSWP5及NbHSWP6之间存在相互作用［47］。SWP5可与家蚕微孢子极管蛋白PTP2和 PTP3相互作用［48］，SWP9与极管 NbPTP1和NbPTP2蛋白相互作用，并且通过盘绕极管附在孢子壁上而促进发芽过程［49］。SWP12是一个含BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域的孢壁蛋白［50］，与NbSWP9通过家蚕微孢子虫孢内壁几丁质结合而参与孢壁的形成和稳定不同［51］，SWP12通过粘附在家蚕微孢子几丁质外壳上维持孢壁的稳定性。此外，SWP5也参与维持孢壁的稳定［48］。在所鉴定的孢壁蛋白中，SWP25、SWP26、SWP30为孢子内壁蛋白［52］，SWP32和SWP5、SWP16为孢子外壁蛋白［53］，SWP7和SWP9在孢子的外壁和内壁均有分布［54］，SWP5、SWP7、SWP9、SWP11、SWP26、SWP15、SWP16都在孢子粘附与感染过程中起到一定作用［55］。

3.3 丝氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitor，Serpin）的研究

丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）是一类数目最多、分布最广、结构相似的蛋白酶抑制物，在人类、植物、动物、真菌、细菌、古生物和某些病毒中均存在。潘国庆课题组从家蚕微孢子虫基因组中鉴定出19个Serpin 基 因 ，并 对 NbSPN6、NbSPN9、NbSPN13、NbSPN14、NbSPN19进行了较为全面的研究。NbSPN6具有和孢壁几丁质层结合的活性，推测其可能具有抑制宿主蛋白酶的作用，或参与调控宿主的免疫进程［56］。在对NbSPN19和NbSPN14互作靶蛋白的鉴定实验中，检测到4个可能与家蚕微孢子虫Serpin蛋白有互作关系的家蚕蛋白质，其中3个主要功能是参与信号转导的蛋白（SH3-domain结合蛋白、毒力相关三聚体自转运蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）在NbSPN19、NbSPN14的互作条带中都出现，暗示NbSPNs可能参与信号转导进程［57］。家蚕微孢子虫NbSPN106氨基酸序列与其他物种Serpin的相似性较低，但仍具有典型的Serpin蛋白保守位点，并且NbSPN106可能参与调节宿主的免疫通路［58］。Nb感染家蚕后的基因芯片数据表明，Nb的Serpin可能通过抑制宿主家蚕血液黑化通路参与微孢子虫的侵染过 程［33，59］。家蚕微孢子虫NbSPN2、NbSPN3、NbSPN6、NbSPN10、NbSPN14和NbSPN19为分泌型serpin，可能被分泌到孢外参与孢子对宿主生理代谢及免疫系统的调控［60］。

3.4 类蓖麻毒素B链凝集素（Ricin-B-lectin，RBL）的研究

凝集素是一类能与细胞表面特殊糖蛋白或糖脂中寡糖结构相结合的蛋白［61］，广泛存在于动植物、微生物等生物体中，具有细胞识别、有丝分裂、病毒毒力决定子等功能［62］，在生命活动中起到重要作用。RBL是凝集素蛋白的一条分支，有研究指出，RBL蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡［63］和增强免疫反应的作用［64-65］。贾立丽［66］通过检索家蚕微孢子虫全基因组数据库的注释信息，得到19条RBL候选基因，序列分析发现家蚕微孢子虫ricin B-lecin基因以串联重复的形式排列在染色体上，而且发生串联重复RBL拷贝间氨基酸序列的差异较大，不仅暗示了RBL可能对微孢子虫的侵染增殖具有非常重要的作用，也表明这些RBL可能具有不同的功能［67］。齐晓冉［68］鉴定了NbRBL3基因，通过免疫印迹分析证明NbRBL3在侵染宿主的过程中被分泌孢外发挥功能，并且NbRBL3重组杆状病毒表达系统的高量表达能够导致家蚕BmE细胞的凝集，但这种凝集的生物学功能尚未明确。LIU等研究认为推测NbRBL蛋白具有与糖类物质结合的分子结构基础，在孢子的侵染过程中，孢子萌发时释放NbRBL，随后NbRBL蛋白通过促进孢子与BmN细胞粘附的方式帮助孢子的侵染行为［69］。

3.5 家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶（subtilisinlike protease，SLP）的研究

家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶超家族是第二大的丝氨酸蛋白质家族，在原核生物、真核生物、以及病毒中广泛存在。家蚕微孢子虫有4个类枯草芽孢杆菌基因，Nbslp1、Nbslp2-1，slp2-2［70］和Nbslp2［71］。党晓群［71］认为NbSLP1在孢子的发芽过程发挥重要作用，并且通过对NbSLP1互作蛋白的分析实验，推测NbSLP1可能还具有水解ATP产生能量和抑制家蚕免疫通路的功能。NbSLP2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥重要作用，并且可能在侵染过程中，与NbSLP1共同参与极丝弹出过程［71］。马强等［72］在感染家蚕微孢子虫72 h后检测到Nbslp2的转录活性，推测其可能在Nb感染家蚕早期发挥作用。

4 研究展望

家蚕微粒子病是具有毁灭性的疫病，是感染家蚕最主要的传染性疾病之一，而家蚕微孢子虫是家蚕微粒子病的病原。因家蚕微孢子虫对蚕业生产造成的重大损失，所以一直以来都是研究者关注的热点。分子生物学技术凭借其特异、灵敏等优势，成为家蚕微孢子虫检测技术研究的重点。家蚕微孢子虫在序列分析方面的研究，为家蚕微孢子虫的分子生物学检测技术提供了序列基础，提高了家蚕微孢子虫孢子分子生物学检测的特异性。但是核酸分子杂交检测技术和PCR检测技术，存在操作难度大、耗时、对仪器的要求高等限制性，未能适应与满足大生产需求，从而限制了这两种检测技术的发展。LAMP技术操作简单、实用性强的优点，促使研究者开发出了可有效检测家蚕微孢子虫的LAMP试剂盒，有望开发此技术用于生产上的大量检测，促进家蚕微孢子虫分子生物学检测技术上升到一个新的台阶。

家蚕微孢子虫全基因组测序完成后，研究者利用相关数据对家蚕微孢子虫开展大量的侵染相关分子基础研究，鉴定相关蛋白的功能，并取得了一定的研究成果。然而，由于微孢子虫突变株构建所依赖的微孢子虫转基因技术目前还未取得全面突破，相关基因在微孢子虫侵染过程中所行使的功能还需深入的研究［67］，家蚕微孢子虫侵染和垂直传播机制仍有待进一步阐明。

尽管家蚕微孢子虫在分子水平上的研究取得了很大的进展，但推进和完善LAMP诊断技术，加快分子诊断技术用于蚕种生产上检测的进程、发掘新的家蚕微孢子虫功能基因、加深对家蚕微孢子虫功能基因组学的研究并阐明家蚕微孢子虫侵染和垂直传播机制，仍是今后研究的方向和热点。更进一步，家蚕微孢子虫作为鳞翅目昆虫的病原之一，积极扩展微孢子虫在鳞翅目害虫的生物防治领域的应用也必将越来越受到关注［67］。