腭突上抬的发生及其分子生物学机制

王亚红 李承浩 石冰

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院唇腭裂外科 成都 610041

腭裂是由腭发生异常所导致的最常见的先天性缺损之一。腭发生有原发腭和继发腭之分。原发腭来源于额鼻突，包括人中和切牙孔前部的一小部分硬腭。继发腭包括切牙孔之后的硬腭和软腭，作为一种机械屏障分隔鼻腔和口腔，保持呼吸和吞咽功能的正常运行。继发腭的形成由腭突生长、上抬及融合的一系列过程组成[1-4]。在小鼠胚胎发生期间，双侧上颌突于第11.5 d朝口腔侧生长形成腭突，双侧腭突沿舌两侧垂直向生长至第14 d，迅速地上抬至舌背上方的水平位并向面部中线靠拢，胚胎第15～15.5 d，双侧腭突接触，腭中缝形成，随着中线上皮带消失，双侧腭突完全融合，继发腭形成。此外，继发腭向上与原发腭结合，向下与鼻中隔融合，形成完整的腭[5-7]。任何过程的异常都会导致腭裂发生，其中90%的完全性腭裂是由腭突上抬失败，继而无法正常接触融合所导致的[8]。

在过去的研究[9]中，对腭突上抬过程最全面的组织形态学研究是在大鼠体内进行的，无法使用遗传学手段满足机制研究的需求。近年来，小鼠的基因学研究方法及靶向突变模型的迅速发展，为探索腭发生、腭裂发生的机制提供了良好的平台。尽管许多基因突变模型小鼠表现出异常（腭突上抬延迟或失败），与其相关的生物学机制依然无明确的结论[4,10]。当前的观点在很大程度上仍然以组织形态学及各种体外研究结果为基础[11]。本文就腭突上抬的发生及该过程所涉及的机制进行综述。

1 腭突上抬的发生过程

过去几十年，关于腭突上抬如何发生及从何开始始终存在争议，最早学者们[12]普遍认为是由腭突快速旋转90°完成的；1940年Lazzaro提出上抬归因于腭突远端以生长为主的退化和水平方向上的延伸；Walker和Fraser则认为腭突上抬的速度太快，无法用单纯的生长来进行解释，而是腭突内侧壁形成突起而远端退化的重塑过程；随后，Coleman[13]和Ferguson[1]提出了与先前观点相反的“非均质化”假说，认为腭突前份简单地向上翻转上抬，而中后份经历了重塑和再定向的过程；Kochhar和Johnson[14]进一步阐明了该假说，认为腭上抬开始于腭突前份和后份2/3的交界处，然后沿两侧扩展；2004年，Chou等[15]利用碳标记的体外研究也表明组织重塑发生在腭发育的前份和后份；之后，Jin等[16]、Yu和Ornitz[11]通过大量的组织形态学研究后进一步解释了“非均质化”假说，认为腭突上抬过程沿前后轴存在区域不均衡性，前份简单地向上翻转，而中后份通过内侧壁水平向突出同时腹侧壁后退来实现再定向。近期，Chiquet等[12]对腭突上皮和间充质不同区域相关的分子标志物表达模式的分析结果支持了这种区域特异性重塑模式假说。具体来说，经比较上抬前后腭突中后份基因表达模式的差异，结果表明垂直腭突的整个舌侧部分向中线移动，而远端的间充质最终移至腹外侧[12,16]。此外，Brock等[17]对生长至上抬阶段小鼠腭突连续切片的研究结果表明，腭突开始上抬时，间充质细胞的方向在后份改变了近180°，而在前份改变了约90°。

近年来，腭突的上抬始于前份还是后份备受争议。Brinkley和Vickerman[18]在体外的研究观察到腭突的内侧部分首先上抬，然而Iseki等[19]、Kouskoura等[20]基于体内的研究表明，舌体的运动对腭突上抬的影响很大。在同胞甚至同一个胚胎的两侧腭突之间，这将导致显著的多变性[11,19,21]。最近，Yu和Ornitz[11]的一项组织形态学研究认为，腭突上抬始于中份到后份，然后向两侧延伸。

早在1940年，Lazzaro就提出两侧腭突的上抬是先后发生的，Walker和Fraser也提出了同样的观点。在之后开展的研究中，Luke[21]、Greene和Kochhar[22]观察到两侧腭突在非常短的时间内依次上抬，通常一侧腭突完全水平，而另一侧腭突保持垂直，其远端远低于舌的背侧，这一观察也证实了腭突上抬是非同步发生的过程。

2 腭突上抬的驱动机制

研究[18,22-23]证实，腭突有自发上抬的内在能力，这表现在去除大脑和舌体的腭突能正常上抬，并且沿纵轴横向切割的腭突部分能再定位。然而，驱动该过程迅速发生的物理力量尚不清楚。目前，学者们已经提出几种假说来解释腭突上抬驱动力的产生机制。

最早的研究[21]认为，腭皱作为腭突的结构支撑来提供腭突上抬的动力。然而，He等[24]的研究表明，上抬不需要腭皱的参与，因为敲除腭上皮中的经典Wnt信号通路基因导致腭皱的形成丧失，但腭突的上抬和融合并未受到干扰；1974年，Lessard等[25]提出了以肌动蛋白为基础的细胞骨架收缩在腭突上抬中的作用，类似于其他形态发生及组织重组中所观察到的，该过程可能由上皮和间充质共同的细胞骨架收缩提供动力，然而这一想法从未得到证实；之后，学者们提出了几个细胞外基质参与腭突上抬的假设，但没有一个得到充分的证实。

1978年，Ferguson[1,26]提出了流行至今的透明质酸假说，认为透明质酸在腭间充质中的高水平积累是腭上抬的动力来源，富含透明质酸的细胞外基质的水合作用使腭突膨胀，致使腭突前份快速翻转上抬。Brinkley和Vickerman[27]利用药理学方法增加腭突中透明质酸的降解，使其在间充质中的积聚水平下降，经体外培养后，腭突后份上抬延迟，而前份未受影响，这表明细胞外基质的水合作用在腭突前份上抬的过程中并未起主要作用，该研究认为透明质酸在腭突间充质的特定区域中以较高的水平积累，并且产生渗透压以驱动腭突内侧向的组织重塑。之后，Lan等[6]利用生物素标记的透明质酸结合蛋白直接检测透明质酸在发育中的腭突间充质中的分布，结果表现出显著差异性。

此外，高尔基相关蛋白golgb1缺失的小鼠表现出腭突上抬失败，同时腭间充质中透明质酸的积累显著减少。Fgfr2的靶向点突变（Fgfr2C342Y/C342Y）小鼠表现出腭突上抬延迟，且腭间充质中糖胺聚糖的积累减少[28]；新近的一项研究中，Li等[29]也观察到Pax9敲除的小鼠腭突上抬失败，同时透明质酸在腭间充质中积聚水平明显下降，而同时敲除Wise则能挽救该过程，并使透明质酸的积累得以恢复。

这些研究为糖胺聚糖的水平与腭突上抬的相关性提供了进一步的证据，然而透明质酸或其他糖胺聚糖是否参与产生腭突上抬的驱动力仍有待证实。

Chiquet等[12]的研究发现，在腭突的中后份，肌动蛋白应力纤维与远端和新形成的内侧壁突起之间的间充质细胞细胞核方向保持一致，由此提出假设：以肌动蛋白为基础的细胞骨架收缩提供腭突中后份上抬的驱动力，而细胞外基质在腭突的不同区域中所存在的组成和刚度的差异促使组织重塑；Nik等[30]在研究中也发现，Foxf2-/-小鼠腭突无法上抬，同时包括韧黏素-C和纤连蛋白在内的几种细胞外基质成分显著下降。该猜想仍需进一步阐明。

3 腭突上抬的基因调控

研究表明，包含Msx1、Osr2、Pax9、Tbx1等转录因子在内的一些信号通路，如Sonic Hedgehog（Shh）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、Wnt、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）等在腭突上抬的过程中起着重要的调控作用[6-7,31-33]。

Shh和FGF10分别表达于腭突的上皮和间充质内，并在腭突上抬期间形成一个正向的反馈回路[34-35]。Msx1通过激活BMP4调节前份腭突间充质细胞的增殖[36]。Tbx1在腭上皮和间充质中强烈表达[37]，Tbx1-/-小鼠表现出腭突上抬障碍，最终腭裂发生，这可能与观察到的腭突宽度减小、舌体高度增加、间充质中透明质酸积累减少、Fgf8表达升高、Fgf10表达下降及细胞增殖与凋亡行为的改变有关[38]。

Osr2和Pax9的表达遍及腭间充质，是调控腭发生的关键因子[39-41]。Osr2和Pax9缺失的胚胎都表现出腭突上抬的失败，同时伴有腭突间充质细胞增殖的减少[40-41]。Ldb1缺失的小鼠腭突上抬失败，且腭突间充质中Pax和Osr2的mRNA表达明显减少[42]。缺失Pax9的腭胚突的间充质中BMP4、FGF10、Msx1、Osr2和上皮中Shh的mRNA水平都显著下降[29]，然而恢复Osr2在腭突间充质中的表达能够在一定程度上挽救该过程[41]。此外，Li等[29]、Jia等[43]还观察到Pax9缺失的胚胎发育过程中经典Wnt通路信号降低，对DKK的药物抑制以及对Wise的基因沉默，都能部分挽救Pax9缺失小鼠的腭发育缺陷。这意味着调控Pax9和Osr2下游的信号通路可能阻止腭裂发生。

Zfhx1a编码一种转录调节蛋白，与包括转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β在内多种信号通路有关，对腭突上抬起重要的促进作用。Zfhx1a功能性丧失的小鼠表现出腭突上抬延迟24～48 h，最终导致腭裂，然而其生长、分化和融合能力均无缺陷[44]。

Wnt-平面细胞的极性（planer cell polarity，PCP）途径的某些因子缺失也能导致腭突上抬异常[45-47]，Wnt5a及其受体Ror2是腭发生中间充质细胞向前定向迁移所必需的[45]。 Wnt5a-/-和Ror2-/-小鼠胚胎都表现出腭突上抬失败[45]。此外，Wnt受体frizzled 1和frizzled 2缺失的小鼠表现出腭突上抬缺陷。约50%的Fz2-/-小鼠表现出腭裂，而Fz1-/-和Fz2-/-突变体均显示腭裂，表明这些受体之间存在功能性冗余[46]。最近，Yang等[47]发现Pricke1作为PCP通路的另一个组成部分，其缺失会引起腭突上抬缺陷，最终表现腭裂。Liu等[48]对Gpr177的神经嵴特异性失活也对腭突上抬造成干扰。PCP途径的胞内信号传导由Rac1、RhoA和CDC42介导[49]。研究[50]表明，腭突上抬前，Rac1水平在腭间充质中呈区域差异性，且体外过表达Rac1培养的腭胚突表现出腭突上抬失败。这些研究[7,32]表明，Wnt-PCP途径引导的腭间充质的形态发生在腭突上抬的过程中至关重要，该途径对细胞行为的调节（如细胞迁移和细胞极性等）可能是腭突上抬的基础。

Gsk3β在多种信号转导途径中发挥作用，最显著的是介导β-连环蛋白的降解。对Gsk3β的靶向干扰导致完全性腭裂，而在胚胎第13.5～15 d利用化学方法使Gsk3β再表达，则能挽救腭裂的发生[51]。条件性敲除腭上皮中的Gsk3β，腭突无法上抬，且上皮细胞增殖下降、凋亡增加[52]。Gsk3β缺失不会影响Wnt/β-连环蛋白通路的活性，上皮特异性敲除编码β-连环蛋白的基因，未能对腭突上抬造成干扰，这表明Gsk3β可能通过Wnt/β-连环蛋白之外的途径来调节腭的上抬[24,52]。

成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）信号通路也在腭上抬中发挥重要作用。Fgfr2的靶向点突变（Fgfr2C342Y/C342Y）导致半侧腭突的腭间充质增殖减少，上抬延迟，最终发生腭裂[28]。ERK/MAPK信号转导通路通常作用于FGFR信号的下游，其有可能在Fgfr2C342Y/C342Y突变体中被过度活化。Spry20是ERK/MAPK信号转导途径的负调控因子，其干扰会导致腭突无法上抬，同时导致腭突前份的细胞增殖速率增加，这表明ERK/MAPK信号转导通路也在腭上抬中起重要作用[31]。

4 小结

近年来，通过分析基因突变模型和体外培养模型的基因表达变化，虽然已经发现多种调控腭突上抬的基因及信号通路，但其潜在的分子生物学机制仍有待阐明，相关假设也有待证实。随着高通量分子和生物化学研究的发展，以及对基因、蛋白质、RNA和其他生长因子认知能力的提高，对调控腭发育的分子网络的认识也将越来越深，这将有助于腭裂的预防及胚胎期治疗，最终有效地防止腭裂发生。