咯利普兰对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后神经运动功能及氧自由基的影响▲

李锋涛 程 斌 贺西京

(西安交通大学第二附属医院1 骨二科，2 骨三科，陕西省西安市 710004，电子邮箱：lft369@163.com)

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)常见于脊髓长期受压且有脊髓损伤症状的患者，多为在行手术减压后出现原损伤平面以下更加严重的部分或全脊髓损伤。其损伤机制主要包括兴奋性氨基酸毒性作用、血脑屏障通透性增加、氧自由基生成和脂质过氧化反应引起的组织损伤、炎性浸润、微血管内血栓形成[1]、细胞凋亡等。研究表明，磷酸二酯酶4特异性抑制剂咯利普兰可显著增加肾脏、肺部及胃肠道缺血再灌注损伤组织内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及过氧化氢酶含量、减少一氧化氮及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的生成，减轻组织炎性反应及改善组织病理变化[2]。但咯利普兰是否能够抑制SCII后氧自由基的生成而保护神经功能，目前鲜见研究报道。本实验通过研究咯利普兰对大鼠SCII后神经运动功能及氧自由基的影响，探讨其对SCII的改善作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 SOD试剂盒及MDA试剂盒购自南京建成生物研究所(批号：20151202、20160117)，咯利普兰购自美国Sigma公司，硫酸鱼精蛋白购自北京悦康凯悦制药有限公司(批号：H11020246)；CH21-3型照相显微镜购自日本Olympus公司，Keypoin型四导联诱发电位肌电图仪购自丹麦Dantec公司，752S型紫外可见分光光度计购自上海棱光技术有限公司。多功能生理检测仪购自日本ColinBD509公司。

1.2 实验动物及分组 清洁级成年健康雌性SD大鼠60只，(3.0±0.5)月龄，体重(223±18)g，购买于西安交通大学医学院动物实验中心(合格证号：陕医动字D08005)。按随机数字表法将大鼠分为假手术组(Sham组)、SCII组和咯利普兰组，每组20只。

1.3 SCII建模方法 Sham组仅于大鼠胸主动脉置管，不阻断血流，不采取任何干预措施；SCII组和咯利普兰组同样于胸主动脉置管，通过扩张球囊阻断SD大鼠胸主动脉30 min，然后恢复血流，建立大鼠SCII模型。建模方法如下：使用3%苯巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉。保持大鼠体温在37.1℃～37.5℃。暴露左侧颈总动脉及尾动脉，与监护仪连接后置入PE50导管，监测近、远端血压(近端导管连接放血装置)。暴露左侧股动脉，置入2F Fogarty导管，置入深度为10.8～11.4 cm，使得球囊位于左锁骨下动脉分支处。充盈球囊，阻断胸主动脉，同时立即通过放血装置开始放血，使近端平均动脉压维持在45 mmHg左右。胸主动脉阻断30 min后，放松球囊，恢复胸主动脉血流，将所放出的血液匀速回输。术后皮下注射0.4 ml硫酸鱼精蛋白(4 mg)。将大鼠放于25℃～30℃的保温箱内，苏醒后放回饲养笼中。室温控制在25℃左右，自由进食及饮水。人工膀胱按摩2次/d，清洗会阴部及腹部1次/d，经常更换笼内锯末，保持笼内干燥、清洁。术后腹腔注射青霉素20万单位/次，2次/d。术后SCII组和咯利普兰组各有3只大鼠因泌尿系感染死亡，均按相同条件给予补充。

1.4 给药方法 将咯利普兰溶于二甲基亚砜中，在建立SCII模型前30 min，给予咯利普兰组大鼠腹腔注射咯利普兰，10 mg/(kg·d)，分4次注射，此后每天按此剂量注射直至实验结束，以维持血药浓度。Sham组及SCII组注射相应体积的二甲基亚砜。

1.5 观察指标 分别于SCII模型建立后6 h、12 h、24 h及48 h，每组各取5只大鼠进行神经运动功能评分并检测体感诱发电位，然后处死大鼠取脊髓组织检测SOD及MDA。

1.5.1 大鼠后肢神经运动功能评分：采用(Basso，Beattie and Bresnahan，BBB)[3]神经运动功能评分方法对各组大鼠后肢神经运动功能进行评分。参加评分者为熟悉评分标准而未参加本组实验人员，共两人进行评分，结果取其平均值。

1.5.2 体感诱发电位检测：将插入大鼠后肢胫后神经附近进行电脉冲刺激，双根银针电极间距1.0 cm，银针直径0.5 mm。刺激参数：强度4 mA，频率3 Hz，波宽1.0 ms单方波，信号叠加500次。在颅骨顶部正中央矢状线旁开1.5 mm处紧贴颅骨放置记录电极，与另一侧相同位置紧贴颅骨放置参考电极，保持电极位置良好。记录电极安放于颅骨表面相对于后肢皮层感觉区，参考电极安放于皮下，灵敏度为5μV，滤波范围10～3 000 Hz。

1.5.3 SOD及MDA的检测方法：取大鼠腰尾部脊髓组织100 g，冰上操作，匀浆后按照试剂盒说明分别应用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法检测各组大鼠脊髓组织中SOD、MDA含量。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠BBB评分比较 在各个时间点，Sham组、咯利普兰组、SCII组BBB评分依次降低(均P<0.05)，见表1。

表1 建模后不同时点3组大鼠后肢BBB评分比较(x±s，分)

注：各个时间点，与Sham组比较，#P<0.05，与SCII组比较，▲P<0.05。

2.2 3组大鼠体感诱发电位检测结果 在各个时间点，Sham组、咯利普兰组、SCII组大鼠后肢体感诱发电位潜伏期依次延长，波幅依次减小(均P<0.05)，见表2～3。

表2 建模后不同时点3组大鼠后肢体感诱发电位潜伏期比较(x±s，ms)

注：各个时间点，与Sham组比较，#P<0.05，与SCII组比较，▲P<0.05。

表3 建模后不同时点3组大鼠后肢体感诱发电位波幅比较(x±s，μV)

注：各个时间点，与Sham组比较，#P<0.05，与SCII组比较，▲P<0.05。

2.3 3组大鼠脊髓组织SOD活力及MDA含量比较 在各个时间点，Sham组、咯利普兰组、SCII组SOD活力依次降低(P<0.05)，而MDA含量依次升高(均P<0.05)，见表4～5。

表4 建模后不同时点3组大鼠脊髓组织SOD活力比较(x±s，U/mg prot)

注：各个时间点，与Sham组比较，#P<0.05，与SCII组比较，▲P<0.05。

表5 建模后不同时点3组大鼠脊髓组织MDA含量比较(x±s，U/mg prot)

注：各个时间点，与Sham组比较，#P<0.05，与SCII组比较，▲P<0.05。

3 讨 论

生理条件下，脊髓组织正常代谢过程中会生成少量的反应性氧类物质(reactive oxygen species，ROS)，可以被内源性抗氧化系统(包括SOD、谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶)以及抗氧化维生素(如维生素E及抗坏血酸)所清除。在SCII过程中，有大量ROS生成，主要包括一氧化氮及超氧阴离子等，当ROS的生成量超过了SOD、过氧化氢酶等清除能力时，可导致细胞膜中磷脂的不饱和脂肪酸过氧化，从而引起细胞膜及细胞器的损害，并通过坏死及凋亡模式引起细胞死亡[4-5]。MDA是生物体内脂质过氧化反应的终产物，可在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性，且具有潜在的致癌性，其含量可反映体内过氧化的程度。SOD分布于各种生物组织细胞内，是机体内清除自由基的最重要物质，其通过歧化反应将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢，再由过氧化氢酶及过氧化物酶将之分解。SOD的活力可反映内源性氧自由基清除能力的水平(在清除自由基的同时，SOD本身被消耗)，因此MDA的含量和SOD活力常常被用于检测体内氧化应激损害程度。研究发现，SOD活性、脂质过氧化与脑缺血再灌注损伤有关[6-8]。

咯利普兰是磷酸二酯酶4特异性抑制剂，可通过抑制细胞内磷酸二酯酶4，减少腺苷-3′，5′-环磷酸的水解，发挥多种生物学功能：(1)可在mRNA和蛋白水平下调T细胞和单核细胞分泌的前炎性细胞因子白细胞介素-13、白细胞介素-5、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的表达，抑制炎性细胞的迁移活化，减轻炎症反应；(2)降低血脑屏障的渗透性，减少有害因子穿过血脑屏障引起的组织损伤；(3)降低诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达和减少一氧化氮等超氧化合物的生成，减少氧自由基的生成，从而减轻其对组织的破坏；(4)抑制促凋亡蛋白活化、激活B淋巴细胞瘤-2蛋白，减少细胞的凋亡；(5)促进新生轴突克服抑制性分子如神经轴突生长抑制因子、髓鞘相关糖蛋白和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白的抑制而生长；(6)阻止Ca2+内流，减少Ca2+介导的细胞坏死通路。研究表明，应用咯利普兰治疗大鼠急性肾盂肾炎，可显著增加肾脏组织内SOD及过氧化氢酶含量，同时减少NO及MDA的生成，从而减轻组织炎性反应及改善组织病理变化，这种抗炎抗氧化减少组织损伤的作用同样存在于肾脏、肺脏及胃肠道缺血再灌注损伤时[9-11]。Sánchez等[12]应用咯利普兰治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠，发现其可明显抑制此类大鼠脊髓和淋巴结内金属蛋白酶-9基因的转录，减轻金属蛋白酶-9引起的组织破坏，还可降低其淋巴细胞核转录因子-κB的表达水平，抑制炎性细胞因子的合成。Martinez等[13]报告咯利普兰明显降低自身免疫性脑脊髓炎大鼠体内一氧化氮的生成，降低颅内中枢神经系统血管内皮通透性，阻止炎性细胞的浸润，减轻组织水肿，起到保护神经组织的作用。而咯利普兰是否能够减少SCII后脊髓组织内ROS的生成，减轻脊髓损伤，改善脊髓功能鲜见报道。

本实验结果显示，在SCII后6～48h，与SCII组相比，咯利普兰组大鼠后肢BBB评分增高(P<0.05)，神经诱发电位潜伏期缩短、波幅增加(P<0.05)，提示咯利普兰能够改善SCII后大鼠后肢神经运动功能和脊髓组织的神经电生理功能。在SCII后，与Sham组比较，SCII组与咯利普兰组脊髓组织的SOD活性均降低，MDA含量均升高，且SCII组SOD活力低于咯利普兰组(P<0.05)，MDA含量高于咯利普兰组(P<0.05)，这表明咯利普兰可提高SCII后大鼠脊髓组织中SOD活性，从而对抗自由基的脂质过氧化作用，减少MDA生成，从而起到保护神经功能的作用。但咯利普兰提高SOD活性，减少MDA生成的具体机制还需要进一步研究。

综上所述，咯利普兰可减少大鼠SCII后氧自由基的生成，从而保护神经运动功能。