2型糖尿病合并不同骨量患者外周血Runx2 mRNA表达与25(OH)D的关系

王信 罗丽娅 肖雪 王勇朋 阳琰 王哲 张旋 李琪 樊思桐 朱玉玉

遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563099

糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并发症严重威胁人类的健康。多年来大多数研究一直从糖尿病与胰腺之间的关系入手，但其发病机制至今尚未完全明确，说明糖尿病发病不仅仅是胰腺问题。25羟维生素D[25 hydroxyvitamin D，25(OH)D]与糖尿病及其并发症、骨代谢等均有关[1-3]。25(OH)D不仅可以改善骨代谢，对保护胰岛β细胞功能、调节炎症和免疫反应有一定的作用，短期补充25(OH)D能改善胰岛β细胞功能[4-5]。25(OH)D对骨形成的影响包括间接作用和对成骨细胞的直接作用。一方面，25(OH)D通过促进肠道钙吸收，提高血钙的浓度，为骨矿化提供必需的原料，从而间接作用于骨形成。此外，成骨细胞表达维生素D受体，是25(OH)D作用的重要靶器官，体外细胞培养实验也显示维生素D可促进人成骨细胞分化、矿化[6]。Runx2是骨形态发生蛋白信号的靶目标，是调节成骨细胞分化的重要因子，骨形态发生蛋白信号转导通路参与了成骨细胞的生理过程[7]。经典Wnt信号通路在成骨细胞(osteoblast，OB)的分化、增殖中发挥重要作用，对骨形成、代谢均起着重要的调控作用[8]。过表达的PPARγ可使Wnt信号通路失活，下调Runx2表达，促进脂肪形成，使得骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，这是脂代谢紊乱与骨质疏松(osteoporosis，OP)这两种疾病相互影响的重要生理基础[9]。目前对于外周血中Runx2 mRNA表达在不同骨量状态下糖尿病患者之间差异及其与25(OH)D的关系，目前国内外尚未见相关研究报道。因此，本研究拟通过检测不同骨量状态下2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者外周血中Runx2 mRNA的表达，初步探讨外周血中Runx2 mRNA表达与25(OH)D的关系，可能为2型糖尿病、OP的早期联合防治提供新的视点。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年7月至2017年6月就诊于遵义医学院附属医院内分泌科住院治疗的初诊T2DM患者150例，据骨密度测定结果分为： T2DM+骨量正常组(A组)50例[年龄(60.5±7.2)岁，男25例，女25例]；T2DM合并骨量减少组(B组)50例[年龄(59.4±6.7)岁，男24例，女26例]；T2DM合并骨质疏松组(C组)50例[年龄(61.0±6.1)岁，男26例，女24例]。选取遵义医学院体检中心年龄、性别相匹配的健康对照者(NC组)50例[年龄(59.9±7.1)岁，男25例，女25例]。取得所有受试者的知情同意并通过医院伦理委员会批准。

纳入标准：①绝经1年以上的女性及年龄≥60岁的男性；②2型糖尿病诊断均符合1999年WHO糖尿病诊断标准，且为新诊断的2型糖尿病患者；③骨质疏松诊断符合1994年WHO 制定的OP诊断标准，通过双能X线骨密度仪测定确诊；④18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2；⑤未接受过任何糖尿病降糖治疗措施，包括饮食、运动疗法；⑥肝肾功能正常，无其他严重器质性疾病及糖尿病急、慢性并发症；⑦正常对照组无糖尿病及痛风家族史；⑧无吸烟史及长期大量饮酒史。排除标准：①1型糖尿病或其他特殊类型糖尿病；②有高血压病史、心脑血管疾病病史、骨折史、急慢性感染、恶性肿瘤病史，合并甲状腺功能亢进、甲状腺功能低下、甲状旁腺疾病、代谢性骨病等内分泌疾病；③妊娠或哺乳期妇女或长期服用避孕药的妇女；④近1个月内使用过影响糖、脂代谢及其他影响体内25(OH)D代谢的药物。⑤近一个月内使用过影响骨代谢的药物如降脂药、类固醇、甲状腺激素、糖皮质激素及降糖药物(TZD、SGLT2I和胰岛素)等。

1.2 研究方法

1.2.1血浆25(OH)D及生化指标的检测：研究对象试验前禁食12 h，禁饮8 h，空腹抽静脉血，测血脂、血糖、胰岛素。电化学发光法(试剂盒购于Roche Diagnostics GmbH)测25(OH)D，高压液相色谱法测定糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)(试剂为美国伯乐D-10配套试剂),Olympus(AU2700)全自动分析仪检测总胆固醇(triglycerides，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lipoprotein-cholesterol，LDL-C)，测定空腹胰岛素(fasting plasma insulin，FINS)采用电化学发光法测定含量(试剂盒购于Roche Diagnostics GmbH)，测定空腹血浆葡萄糖(fasting plasma ghlcose，FPG)采用己糖激酶法，HbA1c水平采用高压液相法测定。Real Time-PCR检测Runx2 mRNA的表达。测血压、身高、体重，计算体质量指数(body mass index，BMI)(kg/m2)、腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.2RNA的提取和cDNA的合成：对所有研究对象采集5 mL外周静脉血，枸橼酸钠抗凝。采用淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞，然后用Trizol法提取总RNA。紫外分光光度计检测RNA在260 nm/280 nm波长处的吸光度值，A260/A280在1.9～2.1纯度符合要求。总mRNA 提取试剂盒及第一条链合成试剂盒由Promega公司提供；Real time PCR 荧光定量试剂盒由Promega公司提供。根据试剂盒说明进行操作。

1.2.3Real time PCR 荧光定量反应体系及过程：提取血浆中总RNA，以总RNA 1.5μg为逆转录反应模板进行逆转录总的反应体积是20 μL。Runx2引物正义：5′-GCTATTAAAGTGACAGTGGACGG-3′；反义：5′-GGCGATCAGAGAACAAACTAG-3′；β-acti引物正义：5′TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG 3′；反义：5′ TGCTGTCACCTTCACCGTTC 3′。反应条件：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，55 ℃～73 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环28～30次，75 ℃终末延伸5 min。退火温度和循环次数Runx2 55 ℃，30个循环；β-actin 58 ℃，28个循环。为了校正误差，本研究利用管家基因β-actin 作为内参，以待测样品目的基因的拷贝数平均值除以该样品内参基因的拷贝数平均值，得到目的基因的相对含量。样品中模板的拷贝数，可由SDS 软件通过所得到的Ct 值从标准曲线上计算得到。

1.2.4设计合成引物：通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Gene数据库，查找人各目的基因的mRNA核苷酸序列及序列号，然后用Primer-BLAST比对引物特异性，由TaKaRa公司合成。各引物的序列见表1。

表1 各基因引物序列(荧光定量PCR测定) Table 1 Specific primers used for real-time PCR

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床指标比较

与NC组比较，A、B、C组FBG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C水平均显著升高，而HDL-C明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与A组比较，B、C组HbA1c、HOMA-IR均显著升高(P<0.05)，而FBG、LDL-C、HDL-C组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；C组25(OH)D水平显著低于NC组、A组及B组；B组低于NC组及A组；A组低于NC组，4组间25(OH)D水平呈现逐渐下降的趋势，即 C组0.05)。见表2。

2.2 Real time PCR 检测Runx2 mRNA 的表达

A组与NC组相比，外周血中Runx2 mRNA表达水平减低，差异具有统计学意义(t=21.256，P<0.05)；B组与NC组相比，外周血中Runx2 mRNA表达水平减低，差异具有统计学意义(t=23.522，P<0.05)；C组与NC组相比，外周血中Runx2 mRNA表达水平减低，差异具有统计学意义(t=23.522，P<0.05)；A组与B组相比，外周血中Runx2 mRNA表达水平升高，差异具有统计学意义(t=24.232，P<0.05)；A组与C组相比，外周血中Runx2 mRNA表达水平升高，差异具有统计学意义(t=24.232，P<0.05)；B组与C组相比，外周血中Runx2 mRNA表达水平升高，差异具有统计学意义(t=24.232，P<0.05)。见表3。

表2 4组间一般临床资料及25(OH)D水平的比较 Table 2 Comparison of general characteristics and serum 25-OH vitamin D levels among the four groups

注：和NC组比较,*P<0.05；和A 组比较，#P<0.05；和B组比较，△P<0.05。

表3 各组中Runx2 mRNA的表达Table 3 The expression of Runx2 mRNA

注：和NC组比较，1P<0.05；和A组比较，2P<0.05；和B组比较，3P<0.05。

2.3 Pearson 相关分析结果

血浆中25(OH)D与性别、年龄、血压、BMI、TC、HDL-C、LDL-C比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Runx2 mRNA表达呈正相关(r=0.548，P<0.05)，与HbAlc、HOMA-IR、TG呈负相关(相关系数r分别为-0.315、-0.323、-0.348，P<0.05)。见表4。

表4血浆中25(OH)D水平与临床指标的相关性分析

Table4Correlation analysis of plasma 25(OH)D levels and clinical indicators

项目25(OH)Dr值P值HbAlC-0.3150.025HOMA-IR-0.3230.023TG-0.3480.041Runx2 mRNA0.5480.025

3 讨论

糖尿病作为一种慢性全身性代谢性疾病，随着经济发展、生活方式的改变及人口老龄化，目前在全球呈爆发趋势。2013年糖尿病患病人数达到3.82亿，预计到2030年全球患糖尿病的人数将达到约4.4亿[10]，其中，2型糖尿病占90%以上，因其高发病率、高致残率而引起人们高度关注。我国至少有6 944万人患有OP，2.1亿人存在低骨量，估计每年用于治疗OP引起中老年患者骨折的费用已高达104亿人民币，而到2020年将超过217亿[11]。有研究显示，血糖水平控制较差的 T2DM 患者因骨量减少而引起骨折的风险较血糖控制良好者及非 T2DM人群高47%～62%[12]。T2DM、骨质疏松症，它们看似独立的疾病，但它们往往并存于同一个体，使患者生活质量更趋下降，加重了家庭及社会经济负担。OP已成为我国第4位常见慢性疾病，T2DM人群中OP的发病率也明显高于正常对照组[13]。T2DM合并OP是指患者体内代谢失衡、骨密度减低导致骨组织微结构破坏和骨脆性增加，从而使得骨折风险大大增加的一种全身性代谢性骨病[14]，给患者带来极大的困苦。由此可见，T2DM、OP这两种疾病均已成为世界上非常普遍的全身代谢性疾病。维生素D 缺乏者不仅容易患骨质疏松，更易患代谢综合征及糖尿病[15]，糖尿病患者中普遍存在维生素D水平的缺乏[16]。Runx2是成骨细胞的特意转录因子，可通过结合成骨细胞特异性原件[17]。Runx2表达可以促进脂肪形成，使得骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，导致OP，但是目前国内外未见T2DM合并不同骨量患者血浆中Runx2 mRNA表达与25(OH)D之间的关系的研究报道，因此，本研究拟从这一问题入手进行探索，可能对临床早期联合防治糖尿病、OP具有重要的意义。

研究发现，1,25(OH)2D3处理OB分化时，OB特异性转录因子Runx2、Osterix等表达增加，使OB分化增强，1,25(OH)2D3可能通过下调PPARγ、SFRP1(secreted frizzled-related proteins，SFRP 1)表达，上调Osterix的表达，继而激活β-catenin信号通路，Wnt/β-catenin信号通路通过β-catenin/Tef-1介导的成骨性转录因子Runx2的活化促进骨的形成[18]，从而阻断脂肪细胞分化，减少外周组织胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，对OB的功能有积极保护作用[19]。生理剂量的1,25(OH)2D3可抑制OB增殖、促进OB分化，补充维生素D可以有效抑制肥胖，改善血脂代谢紊乱，抑制脂肪生成，减轻IR[20]。维生素D有降血脂作用，且25(OH)D与TG之间存在线性负相关[21]，维生素D与IR、体脂密切相关[22-23]。由此可推测，维生素D与糖尿病、OP发生发展密切相关。本研究结果示，与NC组比较，A、B、C组FBG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C水平均显著升高，而HDL-C明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与A组比较，B、C组HbA1c、HOMA-IR均显著升高(P<0.05)，而FBG、LDL-C、HDL-C组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；C组25(OH)D水平显著低于NC组、A组及B组；B组低于NC组及A组；A组低于NC组，4组间25(OH)D水平呈现逐渐下降趋势，即 C组

本研究结果提示，外周血中Runx2 mRNA表达及25(OH)D参与了糖尿病、OP的发生发展，可能机制是外周血中Runx2 mRNA表达减少，维生素复合物形成减少，血浆中25(OH)D减少，维生素D的生物学效应降低，从而引起糖、脂、骨代谢紊乱，导致糖尿病、OP的发生发展。反过来，糖尿病、OP的发生发展，促使血浆中25(OH)D水平进一步减低，这就形成了一个恶性循环。因此，积极补充维生素D可能会打破这一恶性循环，可能也会改善外周血中Runx2 mRNA的表达，对T2DM、OP的防治具有非常重要的作用，但其具体机制有待进一步研究探索。