梨的微繁技术

冉昆，左新学，王少敏*

(1.山东省果树研究所，山东泰安 271000；2.冠县梁堂镇林业站)

微繁技术(Micropropagation)又称快速无性繁殖技术，是指通过植物的胚、组织或器官等进行离体无菌培养，迅速获得大量试管苗的技术。微繁技术具有繁殖周期短、繁殖数量大、可集约化培养等优点。梨的微繁过程包括茎尖培养、增殖、诱导生根及炼苗、移栽等环节，目前已广泛用于西洋梨、白梨、砂梨、秋子梨和新疆梨等。笔者总结了梨的微繁技术方案，供参考。

1 培养基类型

梨树的微繁多采用全量或1/2 MS基本培养基或其改良培养基，也有研究使用LP(Lepoivre)、DKW(Driver-Kuniyuki Walnut)或WPM(Woody Plant Medium)培养基。LP、DKW或WPM培养基与MS培养基主要区别在于NH4+和NO3-的离子浓度及总离子浓度的差异。影响梨微繁效率的5种主要矿质营养因子包括NH4NO3、KNO3、中量营养元素(Ca-Mg-Cl-Mn-SO4-PO4)、微量元素(Zn、Mn、Cu、Co、Mo、B、I)和乙二胺四乙酸铁(Fe-EDTA)。通过对不同基因型梨的分析，确定了对不同性状影响最大的因子分别为品质(中量营养元素、Fe)，叶斑/坏死(中量营养元素)，叶片大小(中量营养元素)，芽的数量(NH4NO3、Fe)和芽的长度(Fe)。通过比较组培苗的生长状态，确定了梨微繁的最佳增殖培养基，命名为梨培养基1和梨培养基2(表1，表2)。

表1 培养基的母液成分及浓度

表2 MS培养基、梨增殖培养基和梨冷藏培养基配方

注：a表示可以用琼脂粉和结冷胶混合物替代。

2 材料

2.1 外植体

休眠期快结束时采集已满足需冷量的枝条，做好标记，4℃保存备用，用于催芽或作为接穗嫁接在砧木上，或在生长季的早期，从温室生长的植株上取幼嫩茎尖。

2.2 所需工具及设备

100mL烧杯、125mL三角瓶、组培瓶、医用纱布、橡皮筋、旋转摇荡器。组培设备和工具(超净工作台、解剖刀、解剖剪、镊子、工具消毒器等)。20%漂白剂(含6%NaOCl或5.7%有效氯)和吐温20(Tween20)。润湿剂(40L水或液体餐具洗涤剂中加入2mL润湿液Siltwet L-77)。50℃热水和20℃冷水。杀菌剂NuCop 50，浓度15mL/4L。保鲜剂Floralife。1L三角瓶(用于催芽)。

2.3 培养基

①1/2液体MS培养基[不含PGRs(植物生长调节剂)，pH6.9]，带盖污染物检测试管16mm×100mm，管内含5mL。②污染物检测培养基，9cm培养皿中加入营养琼脂(NA)。③增殖培养基，每个16mm×100mm试管中加入5mL。④增殖培养基，每个组培瓶中加入40mL。⑤不含PGRs的冷藏培养基。⑥生根培养基，每个组培瓶中加入40mL。

2.4 茎段冷藏

茎段培养至约5cm，转移至半透明塑料组培袋(StarPac袋)、试管或三角瓶中，接种于不含PGRs的冷藏培养基上。低温驯化(-1℃ 16小时黑暗/22℃ 8小时光照)后，置于培养箱或低温室中冷藏(1～4℃)。

2.5 驯化材料

无菌灌封的混合或预制培养基。雾床、透明玻璃试管或玻璃瓶。用于微嫁接的砧木苗。

2.6 微嫁接材料

与微繁茎段具有相同干径的幼苗。微嫁接后用于覆盖植株的玻璃瓶或塑料杯。嫁接刀或手术刀。

2.7 冷冻保存材料

①植株在-1℃16小时、22℃8小时条件下驯化1～4周。②装有预处理培养基(含5% DMSO和8%琼脂的MS培养基)的培养皿。③精细解剖工具及双目低倍显微镜、无菌烧杯和培养皿、2mL无菌移液器、无菌过滤瓶、无菌滤纸。④MS液体培养基(含2M甘油和0.4M蔗糖)。⑤MS液体培养基(含1.2M蔗糖，pH5.8)。⑥恢复培养基(在小培养皿或多孔板中使用不含生长素的标准生长培养基)。⑦冻存管、冻存管架(在冰块或碎冰中预冷)、杜瓦(Dewar)瓶(用于盛装液氮)。

3 梨的微繁方法

梨的微繁效率很大程度上取决于基因型，但也遵循一些适用原则。首先，材料一定要健康、不携带病虫卵；茎段生长活跃、无病症。其次，采集茎段后，对外植体进行细菌和真菌污染物检测，选择无污染的茎段进行增殖。再次，确定合适的生长培养基、冷藏条件、生根步骤及炼苗条件，最终培养出健壮的生根苗。

3.1 培养基配制和灭菌

3.1.1 细菌检测培养基 液体MS检测培养基。配制不含PGRs的1/2 MS培养基(pH 6.9)，取5ml加入16mm×100mm试管。轻微盖上盖，不要盖紧，121℃高压灭菌20分钟后，将盖彻底盖紧。营养琼脂(Nutrient Agar ，NA)检测培养基。配制添加1g/L酵母提取物和10g/L葡萄糖NA培养基。灭菌后微冷却后，倒入9cm培养皿中，培养皿盖半开，冷却45分钟，使多余水分蒸发。平板可在室温下倒置保存2个月。

3.1.2 梨增殖培养基 在烧杯中加入1/2体积的蒸馏水或去离子水，依次加入矿质元素、维生素、蔗糖和PGRs，每次加入后搅拌至完全溶解。用蒸馏水或去离子水定容，混匀。用NaOH或H3PO4调节pH至5.7。加入琼脂等固化剂，加热至琼脂完全融化，分装到高压灭菌的容器中。每个16mm×100mm离心管中加入5mL培养基用于芽的诱导，每个组培瓶中加入40mL培养基用于芽的增殖。盖子先不盖紧，121℃高压灭菌20分钟后，盖子彻底盖紧。将增殖培养基保存在干净的环境于2周内使用。

3.1.3 梨冷藏培养基 冷藏培养基为含1/2 MS氮源、加1g/L琼脂、不含PGRs的梨培养基2。

3.1.4 梨生根培养基的配制 采用快速浸渍的方法生根，配制不含PGRs的标准培养基；若在含生长素的培养基上生根，按注意事项⑥所述的PGRs浓度配制MS培养基。

3.2 外植体采集及消毒

3.2.1 接穗茎段 在休眠期将结束时采集已满足需冷量的接穗，于4℃保存。在晚冬或早春用劈接法嫁接到砧木幼苗上。嫁接后的植株置于温室中，生长至5～10cm时，采集茎段做外植体。

3.2.2 催芽 从冷库中取出接穗，用软刷在自来水下轻轻刷洗。在含润湿剂(2mL/40L)的50℃循环水中浸泡10分钟，立即转移到自来水(-20°C)中水浴10分钟。然后用流动的自来水冲洗，稍晾干，在杀菌剂NuCop 50中(15mL/4L)浸一下(浸铜处理)，彻底吸干水分(浸铜处理时要戴手套)。使用蒸馏水或去离子水稀释FloraLife保鲜剂至10g/L，在1L三角瓶中加入500ml。用对角剪切的方式修剪茎段基部后，接种到组培瓶中，每次剪切后剪子浸在20%漂白水中消毒。将组培瓶置于温室中培养，每周更换1次保鲜液。芽长至5～10cm时，切下3～5cm的茎尖进行表面消毒。

3.2.3 外植体的表面消毒 剪下的茎尖放入100mL烧杯中，烧杯口覆盖纱布，用橡皮筋绑好。烧杯放在塑料盘中，用流动的自来水冲洗10分钟后倒掉水，去除纱布。在装有外植体的烧杯中加入漂白液(10%漂白粉加入3滴吐温-20)，放在摇床上摇动10分钟(转速25～30rpm)。把茎段转移到含无菌水的烧瓶中，漩涡2分钟后，换新的无菌水浸泡2分钟。

3.2.4 外植体修剪及污染物检测 将消毒过的茎段置于无菌滤纸上修剪基部，修剪后置于新的无菌滤纸上。将茎段接种在含1/2液体MS细菌检测培养基的试管中，做好标记。将试管放在培养室中，弱光下培养1周，丢弃染菌的茎段。若1周后培养基无污染，取出外植体，修剪茎段的基部。将茎尖接种到含固体增殖培养基的试管中。剪下的基部在细菌检测平板上划线，留下一部分接种到NA培养基上。平板做好标记并放置3周，观察细菌或真菌的生长状况。如果NA平板3周后没有污染，将外植体转移到含增殖培养基的组培瓶中。如已污染，丢弃所有材料。

3.3 增殖

将茎段分为2或3段(3～5cm)，接种至增殖培养基上，每3周更换1次。根据需要在NA平板上检测是否存在细菌污染。培养条件25℃，16小时光照，70～100μE/m2·s。

3.4 生根

生根前茎段长至5cm。剪去茎段的基部，接种到生根培养基上。若采用蘸根的方法，剪去基部，在10mM IBA或NAA中浸渍5秒后，接种到不含PGRs的培养基中，至根系长至3～5cm。若不生根，在生根剂中浸泡一下，然后移至温室中生长。若仍不生根，将茎段微嫁接于干径相同的砧木上。

3.5 炼苗

组培瓶移至温室的前2天，打开瓶盖，便于空气流动。从琼脂培养基中取出已生根的幼苗，用清水将附着的琼脂冲洗干净后，栽植于营养钵中并置于雾床上，或用透明的塑料袋、塑料杯或玻璃瓶覆盖保湿， 2～4周后移至温室组培架上。

3.6 茎段冷藏

梨的茎段低温驯化后可在1～4℃条件下保存1～4年，中间不需更换培养基。将茎段接种到MS培养基上培养1个生长周期(3周)，然后转移至装有新鲜冷藏培养基的热密封塑料组培袋中。在生长室中培养1周后，在低温条件下驯化1周。驯化条件：1～4℃，低光强(10～20μE/m2·s)或黑暗条件下放置12小时。一般情况下，茎段的保存时间为2～3年。保存时间因基因型而异，所以每隔4～6个月需对保存材料进行1次评估，视情况需要重新繁殖。

3.7 冷冻保存(玻璃化程序)

冷冻保存前2天，从低温驯化的茎段上剪下0.8mm茎尖，并接种到预处理培养基中[含5%DMSO(二甲基亚砜)、增加1g/L琼脂的标准生长培养基]，在培养箱中培养2天(-1℃16小时，22℃8小时)。冷冻保存当天，配制冷冻保护剂PVS2(在MS液体培养基中加入30%甘油、15%乙二醇、15% DMSO、0.8M蔗糖，调节pH至5.8)，使用前过滤除菌，于4℃保存。注意在试验当天将冷冻保护剂混匀并过滤除菌，试验完成后不要存放。在冻存管中加入1mL上样溶液(含2M甘油和0.4M蔗糖的MS液体培养基)，将预处理培养基中的茎尖取出，接种到冻存管中的上样溶液中，冰浴20分钟。

玻璃化程序。在小杜瓦瓶中装满液氮，用2mL无菌移液器小心吸出冻存管中的上样溶液，将茎尖留在冻存管中。在冻存管中加入1mL PVS2，准确计时，处理20分钟(0℃)，注意处理时间不要过长，否则对茎尖会产生毒害作用。处理结束时，将冻存管的盖子轻轻盖上(不要太紧，否则液氮会进入冻存管中)，用镊子将冻存管在液氮中浸15秒。

复温程序。从液氮中取出1或2个冻存管，45℃水浴1分钟，同时搅拌。然后25℃水浴(无菌水或干净的自来水)1～2分钟。打开盖子之前先擦干冻存管外壁的水分，用2mL无菌移液器快速吸除1/2体积的PVS2。立即加入1.2M的蔗糖漂洗培养基。去除冻存管中的溶液，并用漂洗培养基重洗2次。将茎尖转移到滤纸上，然后置于恢复培养基中。茎尖在黑暗中生长1周后，转移到有光照的组培架上培养。

4 注意事项

①蔗糖是组培中最常用的碳源；琼脂通常用作培养基的固化剂，也可使用琼脂和结冷胶(PhytagelTM或GelriteTM)或玉米淀粉和结冷胶的混合物。在培养基中加入2～10μM的6-BA可以诱导腋芽生长。通常情况下，增殖培养基中加入0.01～0.05μM的IBA或NAA，但一般不用GA3，因为GA3可能抑制某些基因型的增殖或生根。②在所有组培步骤中，作为外植体的母本质量最为重要。应选择健康、无病症、活跃生长的茎段。催芽时，每周换水，茎段用干净的剪刀修剪。从之前的嫁接株采集外植体很难成功，而且更易产生细菌污染。嫁接接穗的童性能保持长达两年。③尽早检测污染，以免污染源从一个植株传到其他植株。将外植体放在含有液体检测培养基(1/2 MS，pH 6.9)的试管中培养1周。如果试管变浑浊，说明材料已染菌，丢弃不用；若试管不变浑浊，用外植体的基部在NA平板上划线，将材料转移至含固体生长培养基的试管中培养3周。NA平板用于检测其他污染，如观察到污染，将茎段丢弃；如3周后无污染，则茎段可用于增殖。④使用梨培养基1进行芽的诱导。基因型不同，增殖培养基配方也不同。建议先用梨培养基1，若生长缓慢，再换用梨培养基2。⑤低温驯化可延长茎段的保存时间。多数情况下，22℃，8小时光照(10μE/m2·s)和-1℃，16小时黑暗培养1～2周，对于多数基因型效果显著，可以延长保存时间。⑥一般情况下，梨组培苗的生根都需生长素处理。研究表明，在10mM IBA溶液浸泡15秒对18份梨种质都有效果；12份梨种质先在含10mM IBA的培养基上生长1周后，转移至不含PGRs的培养基上培养3周均可生根；对其他28份种质而言，用IBA生根困难，但用10mM NAA浸泡15秒对其中的8种基因型有效；10份种质可在含10μM NAA的培养基上生根。⑦可通过微嫁接的方法将茎段转移到温室中培养。将茎段(1.5～3.5cm)从培养容器中取出，用改良劈接法嫁接。砧木可以是嫩枝，也可以木质化，但其粗度应与接穗的粗度差不多。砧木在距基部合适的距离剪断，用嫁接刀在砧木干径中央切0.5cm深的切口，在接穗基部剪一个V形切口，将接穗插入砧木中，然后用封口膜捆绑好嫁接口后，必须在上面套一个试管保湿或置于雾床上培养3周，直至嫁接口愈合。之后去除套管，使之适应温室环境。⑧低氮源培养基对梨茎段的保存至关重要。在保存之前的最后一个生长周期保持低氮、低营养，之后的保存培养基中低氮、高营养，保存时间最长。⑨PVS2溶液可使细胞脱水，细胞内残留的水分与液氮接触将玻璃化。置于PVS2中时间过长，细胞将因过度脱水而死亡；而接触时间不足，又会导致细胞内形成晶体而杀死细胞。因此，确定最佳的接触时间是冷冻保存成功的关键。

5 小结

梨的微繁过程包括茎尖培养、增殖、诱导生根及炼苗移栽等环节。先在1/2 MS培养基(pH6.9)或营养琼脂上划线培养1周，以检测茎段是否存在污染。在梨专用培养基上茎段的增殖和生长效果更好；与MS培养基相比，梨专用培养基中含4.4μM的6-BA，而且CaCl2、KH2PO4、MgSO4的浓度更高。多数情况下梨的茎段难以生根。由于基因型的差异，目前尚没有一种适用于所有梨品种组培苗生根的方法；通常在10mM IBA或NAA中浸渍5秒后，接种到不含植物生长调节剂的基本培养基上，可以诱导生根。生根的试管苗可在雾床上进行炼苗后移栽。

注：本文摘译自Reed B M, DeNoma J,Wada S,et al. Micropropagation of pear (Pyrussp.). In: Lambardi M, Ozudogru E, Jain S. Protocols for micropropagation of selected economically-important horticultural plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), 2012, 994. Humana Press, Totowa, N J. 参考文献略。