外泌体在肿瘤中的作用及前景*

王萌萌 综述，孔凡虹，宗曾艳，熊 丹,张秀明△ 审校

(1.深圳大学第三附属医院医学检验科，广东深圳 518001；2.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232000)

外泌体最初发现于网织红细胞分化过程中，是胞浆内的多囊泡体与细胞膜融合后，释放到胞外基质的直径40～100 nm 的膜性囊泡。随着研究的深入，发现几乎所有细胞都可分泌外泌体，且在唾液、尿液、血液、精液、羊膜液、腹水、肺泡灌洗液、乳汁、关节滑液及脑脊液等多种体液中均有分布[1]。而在所有类型的细胞中，肿瘤细胞分泌的外泌体尤为旺盛。外泌体中含有多种生物活性物质，包括蛋白质、核酸及脂质等，外泌体可介导细胞间物质和信息传递，参与抗原提呈、免疫应答、蛋白质和RNA的转运等生理和病理过程。恶性肿瘤细胞分泌的外泌体，可携带多种肿瘤细胞特征性DNA、mRNA、微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)及各种蛋白等，进入肿瘤微环境，在肿瘤细胞和正常细胞之间传递，刺激肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[2]。此外，由于外泌体中含丰富的母体信息且广泛分布于各种体液，便于获取的特点，对肿瘤的早期筛查、诊断及预后评估也具有重要意义。

1 外泌体、微泡及其他胞外囊泡的产生过程及机制

细胞分泌的胞外囊泡大致包括外泌体、微泡、凋亡小体，主要是按照形成方式的不同来划分[3]。外泌体产生于细胞内体系统，随后早期内体发育为晚期内体，晚期内体膜内陷形成多泡小体(MVEs)，最后多泡小体与细胞膜融合，其内大小形态均一的内腔囊泡(ILVs)被释放到细胞外，即为外泌体[4]。在此过程中，细胞内的蛋白质、脂质及核酸可被分选进入ILVs中。同时，晚期内体还可与溶酶体结合对内容物进行降解，或与再循环内体结合参与内容物的回收利用。微泡是由胞浆膜直接向胞外“出芽”产生，直径为50～1 000 nm，没有明确的分子标志，膜成分与原始胞浆膜类似。凋亡小体产生于细胞凋亡过程中，直径为500～2 000 nm，其内含有胞质及细胞器[5]。

众多研究表明，转运必需内体分选复合物(ESCRT)参与了ILVs和MVEs的合成[6]。ESCRT系统包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、SCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ 4种蛋白复合物。ESCRT-0能够识别并隔离内体膜上的泛素化蛋白质，接着在ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ的共同作用下，质膜变形并向内凹陷形成小泡，最后在ESCRT-Ⅲ的剪切作用下与内体质膜分离。ESCRT-Ⅲ最终被ATP酶降解失去活性[7]。然而，也有研究发现外泌体生物合成过程并非完全依赖于ESCRT机制，有研究者发现在少突神经胶质细胞系分泌的外泌体中，PLP的分选不依赖于ESCRT系统参与，而与神经酰胺有关[8]。外泌体释放到细胞外后，可通过胞膜融合、内吞及与靶细胞表面受体结合3种方式进入靶细胞，实现细胞之间的信息传递。

2 外泌体的内容物

外泌体为脂质双分子层结构，其内含有蛋白质、核酸、脂质等多种生物活性分子[9]。外泌体内容物蛋白质、脂质、核酸等组成随细胞类型不同而有所差异，同一类型细胞在不同的外界刺激下如低氧、高糖、炎性反应等，其外泌体的蛋白质和核酸成分也有所改变[10]。

近几年来，通过对外泌体蛋白组学分析，已经发现超过4 000种蛋白质可在外泌体中分离，这些蛋白质一部分在进化上保守，与来源细胞无关，另一部分随来源细胞不同而存在差异，具有细胞来源特异性。外泌体中含有的蛋白质包括膜转运和融合蛋白如GTP酶、annexins、Rab、flotillins，参与MVEs合成的蛋白如Tsg101、Alix，四次跨膜蛋白(如CD9、CD81、CD82、CD83、CD63，热休克蛋白如Hsc60、Hsp90[11]。此外，细胞骨架蛋白、脂质相关蛋白、抗原呈递相关蛋白(MHCⅠ、Ⅱ等)、细胞信号通路蛋白也在外泌体中广泛存在。四次跨膜蛋白、Alix、flotillin、Tsg101、Rab56被作为外泌体特异性的分子标志[12]。

除了蛋白质，外泌体也富含丰富的鞘磷脂、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、神经酰胺等成分，主要是细胞质膜类似成分及随来源细胞不同而变化的特殊脂类[13]。其中，骨形成蛋白、胆固醇、氧甾酮、神经酰胺、磷脂酸、ABC转运蛋白等参与了外泌体的合成过程，外泌体被靶细胞识别与脂质受体的参与有关。此外，外泌体携带具有生物活性的脂质分子在细胞之间传递，对于调节细胞脂质代谢具有一定的作用[13]。

外泌体内含有丰富的核酸，包括基因组DNA、大量的mRNA、miRNA、LncRNA等。恶性乳腺癌细胞的外泌体中还含有mtDNA[14]。外泌体中的mRNA可被靶细胞摄取并在靶细胞内得到表达，揭示了通过外泌体介导细胞之间基因传递的方式。

3 外泌体参与肿瘤多种生理病理过程

越来越多的证据表明，外泌体介导肿瘤细胞之间的信息传递对肿瘤生长、侵袭转移、血管生成、免疫逃逸等发挥重要作用。

3.1外泌体与肿瘤生长、增殖 肿瘤细胞分泌的外泌体能够影响非肿瘤细胞产生肿瘤微环境从而更利于肿瘤的生长和增殖。已有多种体外细胞培养实验证明：加入肿瘤外泌体的实验组同等条件下细胞数量增长更多[15]。如肿瘤外泌体所含的生物活性成分随外泌体进入肿瘤微环境，被包括内皮细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等在内的正常细胞及肿瘤细胞自身摄取，导致下游信号通路的改变，进而对肿瘤细胞生长、增殖、侵袭等产生影响，使其更有利于肿瘤的发展。肿瘤细胞外泌体中富含多种致癌性miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、miR-221、miR-451等，外泌体就携带致癌性miRNA在恶性肿瘤细胞之间传递，可能是调控肿瘤生长、侵袭的机制[16]。肿瘤细胞外泌体中含有的生存素和热激蛋白等能够抑制细胞凋亡从而促进肿瘤的增殖。如YANG等[17]证明膀胱癌细胞外泌体能诱导三级膀胱癌细胞系(T24)的抗凋亡基因Bcl-2表达水平上升和凋亡基因表达水平下调从而促进T24增殖。DONG等[16]最近的一项研究证明人类脐带间质充干细胞分泌的外泌体miR-410能促进肺腺癌的生长。可见，外泌体在肿瘤的生长过程中扮演着重要角色。综上所述，肿瘤外泌体所含的蛋白及RNA在调控肿瘤生长、增殖过程中有重要作用。

3.2外泌体诱导肿瘤血管生成 肿瘤外泌体中含有丰富的血管生成因子能够诱导肿瘤血管生成。研究表明肿瘤细胞外泌体中存在的多种信号分子，如c-Src、IGF-IR、GRK5和GRK6，以及c-Src具有促进肿瘤血管生成的潜能[18]。MROWCZYNSKI等[19]的实验证明携带H63D HFE基因变体的神经母细胞瘤外泌体也可以促进肿瘤细胞生长和WT HFE细胞的血管生成。人脑内皮细胞能通过摄取外泌体分泌的VEGF-A提高血管生成的潜能。肿瘤细胞缺氧时，能促进肺癌细胞分泌富含miR-23a的外泌体，miR-23a能够抑制内皮细胞的EGLN2 和 EGLN1导致HIF1α累积从而促进血管生成[20]。由此，可以推断外泌体可通过血管生成蛋白和外泌体miRNA的转运诱导细胞间信号转导来促进血管生成。

3.3外泌体与肿瘤的侵袭、转移 向远处侵袭及转移是肿瘤的重要特征之一。研究表明，肿瘤产生的外泌体能够通过调节多种信号通路促进肿瘤的侵袭及转移。加上外泌体可携带功能性蛋白质及核酸分子向血清、尿液、脑脊液、唾液等多种体液释放，甚至中枢神经系统外泌体可透过血脑屏障向血液循环释放，有理由推测，外泌体在肿瘤侵袭及转移的过程中发挥了重要作用。许多研究通过对肿瘤外泌体miRNA测序分析发现与肿瘤侵袭转移相关的多种miRNA表达上调。如早期乳腺癌进行淋巴道转移时，外泌体miR-222表达上调。而miR-222通过直接靶向作用于肿瘤抑制因子PDLIM2，激活NF-κB信号通路促进早期乳腺癌细胞的侵袭和转移[21]。ZHANG等[22]研究证明胃癌细胞释放的外泌体可携带EGFR进入肝脏。随后EGFR与肝基质细胞质膜结合，通过抑制miR-26a/b有效激活肝细胞生长因子(HGF)。HGF为转移癌细胞提供“沃土”，促进转移癌细胞在肝脏的增殖[22]。故外泌体介导的胞间交流在肿瘤转移中发挥着重要作用。

3.4肿瘤免疫逃逸 肿瘤外泌体可以诱导肿瘤细胞产生免疫抑制功能，通过免疫细胞传递基因组DNA、mRNA和miRNA，从而使应答细胞具有重编程功能，促进肿瘤进展。外泌体可通过向免疫细胞传递抑制蛋白影响免疫细胞的发育、成熟和抗肿瘤活性。HSU等[23]表明，缺氧可以加速肺癌细胞的外泌体分泌，从而使外泌体携带的miR-103从缺氧的癌细胞中转运到巨噬细胞，通过下调PTEN 增强M2的极化。从而使肺癌细胞通过外泌体抑制肿瘤巨噬细胞功能。此外肿瘤外泌体或可通过抑制免疫细胞功能以逃避肿瘤的免疫检测。有研究将shRNA转导入前列腺癌细胞中敲除Rab27a(DU145KD)基因抑制其外泌体分泌，发现当负载到树突状细胞时，DU145KD比对照组DU145细胞引发更强的抗肿瘤特异性T细胞免疫应答[24]。且外泌体可在免疫细胞向促肿瘤发生和促转移表型修饰中发挥作用。VAN DER VOS等[25]发现胶质瘤细胞外泌体可通过将miR21和miR451的传递将小神经胶质或巨噬细胞调节为免疫抑制表型。随后证明了这种miRNA的转移降低了受体小胶质细胞和巨噬细胞中的c-Myc mRNA，这可能是免疫抑制表型的致病因素。

4 外泌体在分子标志物方面的研究进展

外泌体参与肿瘤多种生理活动，且与正常细胞相比，肿瘤细胞可释放更多数量的外泌体，预示着其可能作为一种潜在的生物标记物用于肿瘤的早期诊断、预后、放化疗敏感性评估，以及治疗研究。肿瘤细胞可释放外泌体进入肿瘤微环境、血清、尿液、脑脊液及患者血液循环中。研究发现，肿瘤患者血清外泌体的某些特定RNA和蛋白质与健康者相比较存在统计学差异，如研究证明通过循环外泌体GPC1水平测定，能从健康人样本中准确区分PDAC患者样本[26]。说明外泌体可作为一种新的生物标志物，为方便取材的血清或尿液基因诊断取代创伤大的组织活检开拓了新的思路。液体活检的最大优势是能够在监测和规划治疗前后提供临床信息。研究证明循环外泌体是肿瘤相关分子(尤其是miRNA)的可靠来源，外泌体中特异性蛋白质和miRNA的表达反映了它们的供体细胞的生理特性[27]。所有的肿瘤都分泌外泌体且与正常细胞相比肿瘤细胞分泌的外泌体含量更多[28]。且随着肿瘤的发展，外泌体内容物的含量和质量都会有所改变，可以借此很好地判断肿瘤所在的阶段。另外，由于脂质双分子层结构的保护，外泌体能在长期极低的温度下维持稳定状态保护生物学特性，具有易于长期稳定储存的特征[29]。当前，已有公司(Exosome Diagnostics)推出全球首个基于外泌体RNA的液体活检产品，这是一种基于血浆外泌体的诊断，可灵敏、准确、实时检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的EML4-ALK突变。说明外泌体液体活检技术应用于临床诊断是必然趋势[30]。KAHLERT等[31]研究发现胰腺癌患者血清外泌体KRAS 和 TP53基因突变，另外一项研究证明外泌体KRAS突变比CA19-9的水平测量更有利于胰腺导管腺癌患者预后分层分析[32]。由此可见，外泌体DNA也可为生物标志物来源。

5 外泌体在肿瘤治疗中的应用

外泌体作为一类细胞来源的天然膜结构，是机体内存在的一种天然的细胞之间的交流媒介，能够传递功能性的生物分子到靶细胞。此外由于脂质双分子层的保护，使其内容物不在转运过程中降解。因此，在药物递送方面的应用研究愈发受到重视，同时，利用外泌体增强机体免疫系统抗肿瘤的能力对肿瘤进行治疗也得到了更多的研究。目前，外泌体在肿瘤治疗方面的应用主要集中在以下方面：用于免疫调节治疗，作为传输化学治疗药物的载体或治疗靶标[33]。外泌体作为药物传输载体具有其天然优势：分子量小，固有的细胞靶向性，循环系统中的稳定性，能自由通过血脑屏障，同时，由于外泌体来源于人体，所以能成功规避免疫排斥反应[34]。SEO 等[35]研究显示，健康小鼠CD8+T细胞活化后，细胞毒外泌体瞬间释放，新生小鼠细胞毒外泌体浸润间叶细胞密度高的血管区域。MSC的消耗与CD8+T细胞外泌体的优先吞噬有关。说明CD8+T细胞除了对肿瘤细胞具有直接细胞毒性外，还能释放外泌体，杀伤间充质干细胞，抑制肿瘤进展。LI等[36]通过小鼠模型发现结合A33抗体氧化铁纳米颗粒(A33Ab-US)的A33阳性外泌体具有良好的大肠癌靶向性，能够靶向递送阿霉素从而抑制肿瘤生长，降低心脏毒性延长小鼠的生存期。这项研究表明外泌体能与目标配体结合靶向传递抗肿瘤药物，从而达到肿瘤治疗的目的。ZHANG等[37]利用细胞联合培养模型证明外泌体通过在体内转运肝细胞生长因子(HGF)siRNA能够抑制肿瘤的生长，表明外泌体外泌体可以作为siRNA的载体用于靶向癌症治疗。目前由于外泌体的标准分离方法的缺乏，以及过低的药物装载效率，ZHANG等[38]已根据外泌体的免疫治疗作用制造出仿生人工嵌合外泌体(ACEs)有望代替天然外泌体用于临床肿瘤靶向治疗。

6 小 结

综上所述，外泌体是肿瘤微环境中的重要组成部分，携带具有功能性的蛋白质、核酸、脂质分子，参与恶性肿瘤微环境中细胞之间的信息传递，对恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、血管新生及免疫逃逸等过程有重要的意义。此外，人体体液中来源的外泌体，包含了多种不同细胞来源成分，寻找针对不同细胞来源的特异性分子标志物，对体液中外泌体的研究及未来“液体活检”的发展也有重要意义，如用于肿瘤诊断及预后复发的指标。此外通过对外泌体内容物的分析也可以判断肿瘤的分期，分级和进展及肿瘤表型的分类和预后。将外泌体运用到精准医疗中，可以检测那些无法通过组织活检鉴定的肿瘤突变，实现肿瘤的早期诊断，提高癌症患者生存率。在治疗方面，将其作为治疗药物传输的载体用于肿瘤治疗也得到了相关的研究，相信随着对外泌体认识的加深，以及越来越先进的外泌体分离、及药物装载方法的出现，其临床应用会越来越广阔，针对外泌体的肿瘤靶向治疗方法也会为患者带来新的治疗希望。