高温环境对犬机体影响的分子机制研究进展

李 强，熊 前，杨前勇，王春亮，余 盼，吴 衍

(公安部南昌警犬基地 江西省警犬良种繁育与行为科学重点实验室，江西 南昌 330100)

热应激主要是指动物机体为应对在高温环境下热平衡被破坏，导致散热受阻所引起的非特异性应答反应[1]，会严重影响新陈代谢，持续的热应激会对机体造产生严重损伤甚至死亡。犬全身几乎无汗腺，不能通过汗液散热，在我国南方夏季高温高湿的环境极易产生热应激，从而对生理机能产生非常不利的影响，同时也极大制约了犬在夏季高温高湿环境下的使用。为缓解高温环境下犬产生的热应激，常采用通风、补水等物理方法降温或者服用缓解中暑药物等[2]。然而，机体体温调节以及维持生理代谢正常都是一个复杂的连续过程，因此有必要在分子水平来分析高温环境对犬机体的作用机制和影响，为进一步应对高温环境对犬的影响提供依据。

1 热应激对机体的影响

犬在温度超过25℃的环境中就会出现热应激反应，在温度超过30℃以上的环境则会产生严重的热应激综合症[3]，所以在南方夏季高温高湿环境中热应激是最容易发生的应激反应。犬发生热应激反应后，在热休克因子(Heat shock factors，HSFs)的转录调控下会合成或增加1类保护机体抵抗热应激损伤的蛋白——热应激蛋白(Heat stress proteins，HSPs)。HSPs存在于大部分生物中，在进化上具有高度保守性，并且是一个蛋白质家族，根据分子量大小和功能的不同，可分为许多种蛋白，如 HSP100、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子HSP[4]。HSPs具有多种生物学特性和功能，在机体众多生理反应和信号通路中发挥重要的调控作用，应激状态下机体内的HSPs则会超表达，有助于机体抵抗热应激损伤，增强机体对高温的耐受性并尽快从热应激损伤中恢复[5]。

1.1 热应激与活性氧活性氧(Reactive oxygen species，ROS)伴随着机体的新陈代谢而产生，是机体代谢的产物，ROS包括氧自由基和过氧化氢等，线粒体由于是生化反应发生的主要场所而成为ROS的主要来源[6]。低剂量的ROS对机体是有益的，参与了细胞增殖分裂、细胞信号传导、蛋白激酶活化和免疫自噬等众多生理过程[7]。在机体处于热应激时则会导致活性氧代谢平衡被打破，机体累积大量活性氧，而高剂量的ROS会引起机体氧化应激，氧化损伤核酸，造成蛋白质变性失活以及肽链断裂，干扰氨基酸代谢，毒害细胞；ROS与细胞膜上的成分发生反应导致细胞膜结构被损伤，通透性增加，细胞内的酶大量进入血液中，发生间质水肿，继而加重氧化损伤，引起细胞受损伤亡，造成器官正常功能损伤甚至衰竭[8]。在热应激反应发生后，机体同时迅速合成HSPs互相发挥协同作用，HSPs能够通过调控氧自由基的代谢来降低机体氧自由基的浓度，帮助机体恢复活性氧的代谢平衡，也可以使得因热应激而失活的DNA聚合酶β恢复活力，碱基切除修复系统得以正常运转来修复DNA损伤；同时HSPs能抑制凋亡蛋白酶(Caspases)的活性，也可以通过干扰细胞凋亡的信号传导来保证细胞的存活，使得机体的生命活动得以正常运转[9]。相关研究显示，HSP27和HSP20在心肌细胞内高表达后能够抑制在影响细胞存活中发挥重要作用的半胱天冬蛋白酶活性，此外HSP27能够参与调节细胞骨架的稳定，从而维持细胞基本形态，减少细胞的凋亡[10，11]。

1.2 热应激与mTOR和JNK相关报道显示，热应激有可能影响生物机体雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)代谢通路，从而抑制蛋白质的折叠修饰以及细胞的生长增殖。mTOR作为雷帕霉素靶分子，对营养分子信号敏感性高，参与调节mRNA的翻译及蛋白质的合成代谢，调控细胞生长增殖[9]。高温环境下动物食欲降低，采食量减少，导致机体能量供应不足，激活了腺苷酸活化蛋白激酶(5-AMP activated protein kinase，AMPK)代谢通路，引起mTOR代谢通路发生一系列变化，进而影响蛋白质合成代谢和细胞生长增殖。此外，在机体能量不足时，HSPs能促使ATP分解为机体提供能量，AMPK也会抑制蛋白质合成代谢、细胞生长增殖等消耗大量能量的生理代谢[12]。Gaballah M等[13]研究显示，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)是一种容易被热应激激活的应激蛋白激酶，能够影响多种转录因子表达，参与调节细胞凋亡信号通路，对细胞生命活动具有重大意义。有相关研究表明，热应激蛋白HSP72作为JNK的抑制剂，可以抑制JNK的磷酸化激活，调控参与JNK促凋亡的多种蛋白的表达，减少JNK诱导的细胞凋亡[14]。研究发现，温和热处理机体后，机体在短时间内会超表达HSP72，HSP72通过作用JNK信号通路来增强细胞对热应激的耐受性，缓解高温环境下产生的热应激对机体造成的损害[15]。此外，据相关分子试验显示，HSP72在作用细胞凋亡的初期即可抑制JNK的激活[13]。

1.3 热应激与机体免疫HSPs具有大分子抗原性，可参与机体的免疫反应，同时HSPs也能够作为抗原分子载体，参与加工、递呈抗原给细胞，促进免疫因子表达，活化树突状细胞，从而引起机体非特异性免疫[16]。相关研究表明，HSP70在外周血中可能参与了机体的免疫活动，抑制TLR-4受体表达，诱导肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)浓度上升[17]。朱骞等[18]分析处于中度热应激状态下犬的HSP70在外周单个核细胞(PBMC)和血液中的表达情况，发现HSP70的表达趋势为先升高后逐渐降低，说明HSP70在热应激初期上调表达有助于组织细胞发挥功能。此外，HSP70在人类白血病细胞中出现表达异常的情况，并且可能与白血病出现耐药性有关，推测的原因可能是HSP70影响线粒体代谢调控细胞凋亡[19]。高表达的HSP70能够作用在线粒体参与的凋亡途径中对凋亡体发挥调节作用的凋亡酶激活因子(Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)，通过与 Apaf-1结合，阻止 Apaf-1参与凋亡小体的形成，从而促进细胞存活[20]。细胞是机体新陈代谢发生的主要场所，处于一个不断生长增殖和更新换代的过程中，所处不同的细胞周期阶段对热应激的敏感性也不同。相关研究显示，细胞在S期或者有丝分裂期时对热应激敏感性高，而在G1或者G2期时对热应激敏感性则相对低一些[21]。细胞在热应激初期时会超表达相关热应激蛋白来保护自身应对热应激带来的损伤，以维持自身正常的新陈代谢，但如果伤害性刺激无法解决，热应激持续存在，就会引起蛋白质变性降解，导致细胞骨架蛋白被破坏，细胞膜通透性增加，诱导免疫细胞分泌炎性因子，发生炎症，甚至发生自身免疫反应，损害机体组织器官，这一切均会影响机体生命活动的正常运转，导致动物休克甚至死亡。

2 热应激相关基因

热应激是影响犬及其他动物最常见的应激因素之一，是一个受到多种基因调控的复杂生理过程，目前已有多个候选基因被发现与热应激相关。罗威等[22]利用转录组测序技术在比格犬和中华田园犬的肾和垂体2个组织应激前后中发现了2个共有的差异基因神经肽B(Neuropeptide B，NPB)和蛋白脂蛋白1(Proteolipid protein 1，PLP1)，这2个差异基因可能是影响比格犬和中华田园犬应激耐受性的重要候选基因；此外，通过基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析发现腺苷受体A1(ADORA1)、代谢型谷氨酸受体1(Metabotropic Glutamate Receptor 1，GRM1)以及核受体NR4A1(Nuclear receptor subfamily 4，group A，member 1，NR4A1)等可能是影响犬品种应激耐受性差异的关键基因。朱骞等[18]发现处于热应激状态下犬HSP70在PBMC和血液中差异表达，表明HSP70在犬应对热应激生理过程中可能发挥重要作用。在其他动物中也发现多个可能与热应激相关的候选基因，可以为寻找犬热应激候选基因提供参考。曾涛等[23]研究北京鸭和番鸭肝脏热应激前后基因表达谱也发现，热应激组中HSP70表达上调。宋晓燕等[24]利用全基因组表达谱芯片检测鸡大脑、肝脏和腿肌3个组织中热应激前后差异表达的基因，发现HSP25和HSPH1在3个组织中表达上调，Bcl-2相关抗凋亡基因3(Bcl-2 associated athanogene 3，BAG3)在3个组织中显著差异表达。姚毅等[25]在鸡脑、肝和腿肌3个组织中通过利用蛋白互作网络发现了1个热应激相关基因蛋白互作网络，即热应激蛋白HSPH1，蛋白折叠相关基因FK506结合蛋白(FK506-binding proteins 5，FKBP5)和细胞死亡蛋白BAG3。

3 小结与展望

热应激是犬最常发生的一种应激反应，会影响犬的生理机能，尤其是对处于南方夏季的工作犬而言，极大地干扰了工作犬的正常使用。在分子水平研究热应激对犬的影响可以加深对犬热应激的理解，为采取更有效的应对措施提供理论依据。目前，国内外在热应激对犬影响的分子机制上的研究还不够深入，热应激相关候选基因研究还不足，主要研究集中在犬机体处于热应激下生理生化的指标变化，热应激对犬细胞生长增殖和凋亡的影响以及犬机体产生热应激蛋白来应对热应激对自身的影响，但对于热应激如何影响犬的分子机制还有待进一步研究，这将是今后研究犬热应激的一个重点。此外，犬热应激候选基因互作以及涉及的信号通路研究也是未来的研究方向。