鱼类精子超低温冷冻保存技术研究进展

周 洲， 孔 杰， 赵 凤， 蒋晓红

(贵州省农业科学院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025)

利用精子超低温冷冻保存技术，将品种优良的养殖鱼类及濒临灭绝鱼类的精子冷冻保存起来，建立相应的鱼类精子库，可以避免因鱼类栖息环境污染、过渡捕捞及外来物种入侵而造成的鱼类资源的衰退或工厂化养殖中长期的近亲交配导致的鱼类种质资源退化及变异现象[1-2]，并为鱼类杂交育种、雌核发育、性别控制、转基因等生物技术研究不间断地提供材料[3-4]。同时，鱼类精子的超低温冷冻保存可以解决鱼类育种过程中的诸多实际问题，如对于大鲵、花狼鱼等养殖鱼类雌雄鱼不同步成熟，可以利用超低温冷冻保存的精子诱导雌鱼产卵，从而实现鱼类的成功繁殖[5]；可以实现性逆转及地理隔离的养殖鱼类品系得以交配，如针对黄鳝等性逆转的个体在杂交育种中不能自然交配等遗传育种问题，可以使用超低温冷冻保存的精子，采取人工授精的方式，使远缘杂交可行，促进水生动物种质资源开发与改良[6]。

鱼类精子同鱼卵和胚胎相比，具有体积小的特点，抗冻剂容易通过，冷冻保存较易成功。自1953年英国学者BLAXTER[7]首次成功对大西洋鲱鱼(Clupeapallasi)进行冷冻试验以来，鱼类精子超低温冷冻保存技术已有较大突破，目前已有200多种海淡水鱼类精液得到成功保存，国外研究成功的鱼类包括褐鳟鱼(Caspianbrowntrout)[8]、日本鲟[9]、虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)[10]、大西洋鲑(Salmosalar)[11]等；在我国也取得了一些成效，如黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[12-13]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[14]、白斑狗鱼(Esoxlucius)[15]、真鲷(Pagrosomusmajor)[16]等。笔者从抗冻剂、缓冲液、降温及解冻速率等方面介绍了鱼类精子超低温冷冻保存技术的研究进展，旨在给鱼类种质资源保护和鱼类遗传育种研究提供参考。

1 精子冷冻保存技术的生物性原理

鱼类精子排出体内后，由于外界温度显著高于体内，致使鱼类精子加快对携带能量的代谢速度，又加之精子不能利用外界环境中的能量物质，从而精子存活时间很短，只有将精子放置在低温环境下保存才能有效地延长存活时间。

鱼类精子超低温冷冻保存技术是通过选择合适的渗透液，按照一定的稀释比例将鱼类精子稀释后，为满足精子在低温冷冻保存过程中将低温损失降低到最小(冰晶损伤、溶质损伤等)，让精子迅速通过危险温度区(0～-60℃)到达超低温状态(如-196℃的液氮等)，从而让精子进入休眠状态。待需要时，通过合适的解冻速率将休眠状态的精子恢复到常温状态，并且保证精子具备正常的受精能力[11-13]。

2 鱼类精子冷冻保存研究进展

不同种类的鱼其精子的生物学特性不同，对于冷冻保存步骤、抗冻稀释液的选用及降温平衡等方面的要求也不尽相同。针对不同种类的鱼类精子低温冷冻保存技术展开研究，其研究内容主要包括抗冻剂、稀释液、降温和解冻速率等。

2.1 抗冻保护剂

抗冻保护剂由抗冻剂和稀释液两部分组成。不同鱼类的精子对抗冻保护剂的成分和浓度要求不同，在进行超低温冷冻保存试验之前，大部分研究人员都会根据其生理特性进行筛选。适宜的抗冻保护剂能最大限度地减少精子损伤，起到良好的保护作用，反之则会毒害细胞。

2.1.1 抗冻剂 抗冻剂在鱼类精子超低温冷冻保存中发挥重要的作用，其可保护精子在超低温保存过程中免受冰冻损伤(冰晶损伤、溶质损伤等)，同时可以起到调节细胞渗透压的作用[17]。由于不同鱼类精子细胞膜对不同抗冻剂的通透性不同，导致鱼类对抗冻剂的选择具有特异性。目前最常用的抗冻剂有二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PG)、乙二醇(EG)、甘油(GLY)、甲醇(MeOH)等[18]。如鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)[19]、大菱鲆(Psettamaxima)[20]、大西洋鲟(Acipensersturio)[21]和半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[17]等鱼类精子选择二甲基亚砜作为抗冻剂，冻存精子效果明显；丙二醇和二甲基亚砜保存圆斑星鲽(Veraspervariegatus)精子，激活后精子的受精水平与鲜精相似[22]；丙二醇和乙二醇对真鲷(Pagrosomusmajor)精子都起到很好的冻存效果且无显著差异；10%甲醇对黄颡鱼精子冷冻保存有较好的保护效果[12，23]；鲤、团头鲂、草鱼、鲢及鳙等5种淡水鱼类选择13% 二甲基甲酰胺(DMF)作为抗冻剂，解冻后的受精能力同鲜精相比无显著差异[13]；花鲈[24]、大黄鱼[25]选择甘油作为抗冻剂都起到很好的冻精效果。

精子抗冻剂在保护精子免受冻伤外，还对精子具有负面作用，如二甲基亚砜会对细胞产生毒害作用，影响精子的抗冻效果以及冻精解冻后的活力等[26]。由于抗冻剂的毒性会随着添加浓度的增加而增加，且受到添加抗冻剂的平衡时间和温度影响，因此，选择最适的抗冻剂时要在抗冻剂的品种和浓度上进行选择，保证最大限度发挥其抗冻保护作用，并最大限度地降低其负面作用。为了降低抗冻剂的毒性，一般会通过优化选择低毒低浓度的抗冻剂、降低抗冻剂同精子的平衡时间及非渗透性抗冻剂等方法来保持细胞膜的完整性。陈松林等[26]采用分步添加法成功降低了二甲基亚砜对精子的毒害作用；华泽钊等[27]研究发现，22.8% 二甲基亚砜 + 17.2%乙酞胺混合作为抗冻剂是40%(W/V)的二甲基亚砜单一抗冻剂毒性的1/3，即抗冻剂混合后使用可中和抵消部分单独使用时的毒性。

2.1.2 稀释液 稀释液的选择是精子超低温冷冻保存的重要因素，稀释液既是精子保存环境pH、渗透液的调节剂，又是精子能量来源的源泉[1]。与抗冻剂相比，稀释液对精子一般没有毒性，而且不会激活精子。稀释液的种类较多，到目前为止还没有一个统一的说法[28]。不同鱼类精子对超低温冷冻保存所用稀释液的要求也不同。已用过的稀释液成分主要有盐类(如NaHCO3、NaCl等)、糖类(如葡萄糖、果糖等)、脂类(如磷脂)和蛋白质(如小牛血清等)以及其他添加剂(如甘氨酸、抗生素等)[2]。不同种类的稀释液在保证精子生存环境的前提下，其成分组成越简单越好[29]。如以HBSS液为稀释液冷冻保存的黄姑鱼精子激活率达(79.25±3.86)%～(85.25±3.95)%[30]；以D-15为稀释液冷冻保存草鱼(Ctenopharynodonidellus)和鲢(Hypophthalmich)的研究表明，其解冻激活率分别达55%和70%[1]；以D-17作为稀释液冷冻保存鲤(Cyprinuscarpio)、团头鲂(Megalobramaamblycephala)精子的研究表明，其解冻激活率可达70%以上[1]；以Cortland液为稀释液冷冻保存的黑鲷和大黄鱼精子，激活率最高，分别达(92.91±1.25) %和(89.93±1.07) %[31-32]；以Hanks’液作为稀释液冷冻保存大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)精子的研究表明，其解冻激活率可达76.6%～80.0%[33]。

2.2 降温、解冻速率

鱼类精子能在超低温状态下长期保存，但是在冻存和解冻过程中容易受到损伤，如渗透压的变化、降温及解冻速率、冻融等引起的损伤，所以需要采用合适的速率降温及解冻。

2.2.1 降温速率 降温速率会使细胞发生不同的生理变化并产生不同的损伤。当降温速度过快时，精子细胞内的水分可能来不及代谢到细胞外，受低温的影响而形成结晶，也就是所谓的细胞内冷冻损伤；当降温速率过慢时，鱼类精子长期放置在稀释液和抗冻剂的溶质环境中，造成平衡时间过长，可能会导致精子外界环境pH及渗透压的变化从而造成损伤[34]。目前，较常用的方法是二步降温法(首先是鱼类精液在4℃平衡后，将冻存管在液氮面上1～10 cm放置2～10 min，然后在液氮面上放置一段时间或者直接投入液氮中)[35]和干冰压片法(将稀释后的精液迅速在干冰上压片，冷冻5 min后投入液氮中保存)，如虹鳟[36]等。也可以将鱼类精子直接投放于液氮中保存，也可获得很好的保存效果，如大黄鱼[25]。

2.2.2 解冻速率 解冻速率与解冻液的初始温度、精子与解冻液的比例、精子的体积和水浴的温度均有密切关系，即冷却降温与解冻复苏的速率要相适应，需经历相似过程。同降温过程相似，解冻过程也会受到冻损，可能造成精子细胞内的水分形成重结晶[1]。目前常用的方法是水浴，绝大部分研究均以25～30℃水浴解冻[37]。对于解冻速率已开展了很多研究，但不同鱼类精子适用的解冻速率不同[38]。林丹军等[25]用室温(21～25℃)解冻法解冻大黄鱼的效果良好；KEBBY等[39]采用快速解冻(50～60℃)条纹狼鲈精子，其解冻效果与慢速解冻无显著差异。西伯利亚鲟[40]及红拟石首鱼(Sciaenopsocellata)[41]精子在不同的降温步骤及不同的水浴复苏温度下表现出相似的精子活力。

2.3 精子活力检测

目前的超低温冷冻保存技术研究大多采用精子活力来判断冻存效果，但不同的检测方法得到的结果不一致，导致目前尚未建立统一的精子活力标准。国内外最常用的精子活力检测方法是计算机辅助活力分析(CASA)，目前已被广泛用于分析庸鲽(HippoglossushippoglossusL.)[42]、斑鳜(Sinipercascherzeri)[43]、斑马鱼(Pteroisvolitans)[44]等的精子活力。精子活力检测发生在冷冻保存的精子在解冻激活后的很短时间内，因此要在短时间内检测出精子的各种活力指标存在难度。周磊等[44]研究斑鳜精子冷冻保存试验表明，将显微镜观察和计算机辅助活力分析(CASA)配合使用比独立使用其中一种检测方法得出的精子活力值更具有说服力。

3 小结与展望

鱼类精子冷冻保存技术在保护物种多样性上的应用前景广泛，诸如鱼类冷冻精子库的建立、杂交育种、雌核发育、性逆转等。但是鱼类精子超低温冷冻保存的过程很复杂，鱼类精子需要经过pH及渗透压变化、降温及解冻过程及细胞脱水结晶等内外环境的变化。鱼类精子冻存解冻受到的损伤必然导致激活后授精能力的下降。如何既能发挥超低温冷冻保存技术的优点，又对鱼类精子造成的伤害同鲜精相比差异较小是国内外学者共同研究的方向，这就要求对超低温冷冻保存技术的各个环节进行筛选优化，摸索建立不同鱼类可重复、成本低的精子超低温冷冻保存技术体系。