酶处理蔗渣的国内研究进展

陶 平，刘学文，余希文，余构彬

(1广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所) 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2国家糖业质量监督检验中心，广东广州510316)

0 引言

甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗经压榨机压榨提取蔗汁后，产生大量纤维性残渣(蔗渣)，其中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素等。可用于造纸、栽培基质、能源等领域[1]。我国制糖行业每年产生几千万吨蔗渣，由于蔗渣转化和利用技术欠缺，除少量用于造纸外，大多数蔗渣被作为燃料直接烧掉，导致全生物量利用率较低，而且还污染环境[2-3]。因此，如何充分利用蔗渣，提升其附加值，从而提高甘蔗的全生物量利用率，具有十分重要的意义。

酶制剂作为生物催化剂，具有高效专一、经济、环保等特点。随着生物工程技术的不断发展，酶制剂被广泛应用于食品加工、农产品加工等领域[4]。酶制剂在蔗渣处理中的应用，既可减少多种化学试剂的使用，降低能耗和污染，又能提高甘蔗全生物量利用率和产品质量，增加经济效益[2]。因此，酶制剂越来越受重视，具有良好的发展前景。

本文对漆酶、木聚糖酶及纤维素酶等在国内蔗渣处理中的应用研究进行简要概述，希望推动酶制剂在我国蔗渣处理中获得更广泛的应用。

1 漆酶(Laccase)

目前制糖工业副产物蔗渣主要用于造纸、燃料、复合材料及栽培基质等领域，其中主要含有半纤维素和木质素，含量分别为25%～30%和20%～25%。半纤维素主要由各种单糖(如木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等)和 4-O-甲基葡萄糖醛酸以β-D-呋喃果糖苷键、葡萄糖苷键和酯键连接具有支链的复合聚糖，容易被分解利用[5-6]。木质素是包括紫丁香基、愈创木酚基和对羟基苯的类苯基丙烷结构单元通过C-C键和醚键聚合形成的无定形三维立体多酚网状高分子化合物[7]。

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，属铜蓝氧化酶。由多肽链、糖配基和铜离子活性中心组成。铜离子活性中心主要由1个Ⅰ型铜(T1)、1个Ⅱ型铜(T2)和1组自旋耦合的双核Ⅲ型铜(T3)组成，对催化活性十分重要。催化时T1从底物中吸收电子转移给T2和T3组成的三核簇，氧分子通过指向T3铜的通道进入漆酶获得电子生成水，随后从T2铜指向外部的通道离开。漆酶可以氧化降解木质素和酚类物质[8-9]。有研究证实漆酶能有效脱除蔗渣中的木质素。其作用机理为：有氧存在条件下，能将木质素中的酚羟基氧化为酚氧自由基，随后酚氧自由基进一步发生氧化而断裂，生成羰基木质素或醌类物质，导致木质素大分子降解；或酚氧自由基缩合，形成大分子物质。因此，通过控制酚氧自由基的去向，即可实现木质素的降解或缩聚。漆酶酶解蔗渣木质素主要产物为对羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛、丁香酸、香草酸和乙酰丁香酮等，这些芳醛类物质被广泛用于香料、医药和农药领域，还可用作漆酶漂白的天然介体[10]。另一方面漆酶降解木质素能够破坏木质素、纤维素及半纤维素形成的致密结构，有利于提高蔗渣纤维素和半纤维素的利用率[11]。目前漆酶处理蔗渣主要应用于生物质的处理(半纤维素的提取等)和造纸方面(改善纸张性能等)。

研究发现，利用蔗渣提取半纤维素时，用漆酶进行预处理，蔗渣表面明显分层，有片状结构生成，并有大量新的孔洞产生，总孔体积和比表面积显著增加，提高酶对蔗渣的接触面积。处理后蔗渣半纤维素的溶出效率及半纤维素得率明显提高，半纤维素产率高达 89%，提取时间显著降低。而且半纤维素分子量更高，相对分子质量分布均匀，分散度更低，蔗渣半纤维素组成几乎无差别，有利于半纤维素的高附加值利用[11-12]。黄吉振的课题研究结果显示，提取蔗渣半纤维素时，漆酶处理蔗渣最适反应条件为加酶量120 U/g，固液比1∶15，温度50℃，pH=5.0，反应时间 5 h[12]。漆酶在蔗渣造纸中也有较好效果，研究证实，漆酶改性蔗渣TMP可以提高纸浆可漂性；节约27%左右的能耗；改善纸品光学性能和返黄值，提高白度3.3%～7.59%(ISO亮度)，不透明度下降；明显改善成品纸的抗张、撕裂强度及紧度。蔗渣造纸时漆酶处理蔗渣TMP的最宜条件为酶用量6 LAMU/g，温度50℃，pH=5.0，0.05%介体ABTS，通氧处理1.5 h[13-15]。李兵云等发现利用漆酶/天然介体处理蔗渣浆，木素中游离羟基结构无明显的变化，处理时其中的 β-O-4结构容易脱除，导致Ar-CH=CH结构增加，木素侧链Cα位羟基氧化，生成α-羰基。再经H2O2漂白后白度增加6.4个ISO亮度[16]。

2 木聚糖酶(Xylanase)

木聚糖是自然界中含量最丰富的多糖之一，由高聚木糖主链构成，是蔗渣半纤维素的主要成分[17-18]。低聚木糖(木寡糖)是一种由 2～10个木糖分子以 β-1,4-糖苷键结合成的低聚合度糖，主要由木二糖、木三糖和木四糖组成，具有多种生理功效，一般利用富含木聚糖的植物或农业副产品加工制备[19]。木聚糖酶是能够降解半纤维素生成低聚糖和木糖的一类酶，它是半纤维素酶系统的重要组成部分，包括内切-β-1,4-木聚糖酶、外切-β-1,4-木聚糖酶、β-木糖苷酶[20]。作用机理为内切-β-1,4-木聚糖酶切割半纤维素的 β-1,4-木聚糖主链内部的木糖苷链，主要酶解产物为低聚木糖；外切-β-1,4-木聚糖酶主要通过作用于木聚糖和低聚木糖的非还原端彻底降解木聚糖，产物为木糖；β-木糖苷酶水解低聚木糖末端，释放木糖残基[21]。木聚糖酶同样被用于造纸工艺(纸浆生物漂白)，目前普遍认为主要是通过酶改变纸浆结构、性质及成分达到辅助漂白的效果，但其具体作用机理尚无定论。木聚糖酶处理蔗渣的产物低聚木糖具有对双歧杆菌高选择性增殖效果、防龋齿、促钙吸收、降血压、调节免疫等特殊生理功能，广泛应用于食品和饲料行业[22]。

酶解蔗渣制备低聚木糖的研究发现，碱处理后的蔗渣在酶量5 g/L，温度40℃，pH=6的条件下酶解4 h，60.17 g/L物料可获得31.13 g/L平均聚合度2.64的木聚糖。而且小试实验结果发现6 kg蔗渣酶解后可产出9.942 L低聚木糖液(浓度29.62 g/L)[23]。赵力超等以草菇为表达载体，研究了重组多功能木聚糖酶酶解蔗渣生产低聚木糖，结果表明该木聚糖酶表现出很高的内切-β-1,4-木聚糖活力，产物主要为木二糖和木三糖。该酶水解蔗渣生产低聚木糖的最适参数为酶量900 U/mL，底物110 g/L，酶解80 min。该参数下酶解率为 23.94%，产物低聚木糖的DP值达到3。而且底物利用率跟底物纯度成正比，木聚糖纯度为75%时，酶解率可达到50%[19]。何亮亮等分析了不同条件对低聚木糖得率的影响，由此得出木聚糖降解蔗渣木聚糖最优酶解工艺参数，为酶量3.7%，温度47℃，pH=5.3，酶解6 h。此条件下低聚木糖平均聚合度 2.28，而且得率较高，达到82.04%[24]。此外，研究发现木聚糖酶在蔗渣造纸的纸浆漂白工艺中也有较好效果。一般认为，并非木聚糖酶直接参与了纸浆漂白，而是通过改变纸浆结构、性质和成分，间接辅助漂白工艺。蒋磊的课题研究发现木聚糖酶Shearzyme 500L处理蔗渣浆的最佳处理参数为酶量3 FXU/g，温度45℃，pH=5.0，酶解120 min。处理后浆料中纤维长度增加，细小纤维含量降低，纤维表面出现明显裂痕，褶皱程度加深。纤维素含量增加了 4.13%，聚戊糖含量下降2.25%，白度增加5.7%(ISO亮度)[20]。付希尧利用另一种商业化木聚糖酶 Pulpzyme HC 2500处理蔗渣浆，发现该酶预处理蔗渣浆最佳反应参数为酶量2.5 IU/g，浆浓6%，温度55℃，pH=7.5，反应时间1.5 h。处理后聚戊糖含量下降37.4%，纤维的长宽比增加，细小纤维含量下降，有助于提高纸张的物理强度。纤维表面变粗糙，产生较多孔洞，这与蒋磊的实验结果基本一致[25]。

3 纤维素酶(Cellulase)

蔗渣中含有大量纤维素，含量约 42%～50%，因此如何利用蔗渣中纤维素成为蔗渣高值化利用的首要任务。纤维素是由 D-葡萄糖基以 β-1,4-葡萄糖苷键连接而成的链状大分子，在氢键作用下，部分纤维素分子形成结晶或类结晶的微纤丝，导致纤维素较难分解利用[5-6]。

纤维素酶一般由多种水解酶组成，是一类能将纤维素水解成低聚糖或葡萄糖的酶。一般认为纤维素酶可分为 3类：内切葡聚糖苷酶(endo-1,4-βglucanase，EG 或 CMCase)；外切葡聚糖苷酶(exo-1,4-β-glucanase)；β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)[26]。关于纤维素酶是如何发挥作用的，目前存在几种观点，其中协同作用机制假说接受度较高，降解纤维素时，外切葡聚糖苷酶首先作用于结晶纤维素表面，破坏纤维素的结晶结构，随后内切葡聚糖苷酶发挥作用，催化生成寡糖和纤维二糖，最后β-葡萄糖苷酶进一步将中间产物降解为葡萄糖分子[27]。

纤维素酶已被应用于食品、造纸、纺织、畜牧、能源等领域。在国内制糖工业中也有广泛研究。早在1974年国内就出现了纤维素酶酶解蔗渣的研究，该研究小组发现，蔗渣经NaOH处理后，按比例加入产纤维素酶菌种，pH=5.0，50℃下酶解24～36 h，蔗渣纤维素转化率可达 80%以上[28]。刘志佳等[29]的实验结果表明，经亚硫酸盐预处理的蔗渣在加酶量7.5 FPU/g(以干蔗渣计)，50℃，反应72 h的实验条件下，纤维素水解效率最高能达到83.76%。郑成等[30-31]研究蔗渣的酶法水解条件，并探讨了酶解的动力学模型，发现该酶解反应为非竞争性可逆产物抑制反应。以经2.0 MPa，120℃直接加热膨化20 min的蔗渣为底物，用纤维酶粉进行水解，固液比5%(w/v)、酶浓度 1.28 g/L时，水解适宜条件为pH=4.2～4.9，50℃，反应时间为48～52 h。此条件下，还原糖得率不受缓冲液种类和离子强度的影响。林金莺等[32]研究蒸汽预处理蔗渣酶法水解工艺，结果表明蒸汽预处理(220℃，2220 kPa)能溶解大部分半纤维素，并增加对纤维素的水解作用。最经济水解条件为纤维素酶 2.5 FPU/mL，水不溶性底物15%(w/v)，反应时间为48 h。弱碱性亚硫酸盐预处理(亚硫酸钠用量18%，温度160℃，保温时间60 min)后的蔗渣纤维素酶酶解最佳反应条件：酶用量 30 U/g，液比 1∶20，温度 50℃，pH=4.8，反应时间72 h。其葡萄糖得率达50.9%，木糖得率23.0%[33]。微波预处理结合纤维素酶酶解蔗渣的研究结果显示，微波预处理工艺(按1∶50固液比，280 W微波功率，用1% NaOH和1% H2SO4先后处理10 min、5 min)能有效破坏蔗渣的致密结构，比较4种商品化纤维素酶酶解经预处理蔗渣的情况，发现纤维素酶酶解效果最好的为日本Yacult R-10，其最佳反应条件为加酶量 2 g/L，pH=5.5，温度 50℃，反应时间为12 h[34]。黄祥斌等研究不同纤维素酶酶解蔗渣的差异，发现最高水解率为 62.2%，最低水解率为43.1%。在纤维素酶制剂中加入半纤维素酶，能提高蔗渣水解率，最大增加31.0%[35]。佟新新[36]在其课题研究中，获得了重组纤维素酶，研究其酶学性质，并筛选酶解蔗渣效果最好的纤维素酶组合，同时确认该酶组合最适酶解条件为 pH=5.0～6.0，温度 55℃，反应时间15～16 h。最新研究结果显示，酶法制备甘蔗渣微晶纤维素时，最佳工艺条件为加酶量0.4%，pH=4.5，温度48℃，该参数下微晶纤维素得率为 94.9%，而且粒度更小，均匀性更好[37]。蔗渣酶法水解液的膜分离实验研究发现，聚醚砜膜(分割分子量=10000 u)对纤维素酶的截留率为 100%，膜回收的酶活性率只有 56%。发酵液的吸附和 pH值对过滤通量无明显影响，过滤通量与液体流速只在2～4 m/min范围内表现为正相关关系，其他流速对通量没有影响[38]。杨海燕等[39]通过研究基于酶回用的蔗渣酶解糖化工艺，发现酶解反应后，有约 2/3的游离态酶存在，使用超滤法进行纤维素酶回收，回收酶解效率相当于新酶的60.87%，再利用时只需补加30%的酶量。

4 其他酶类

一些研究发现在处理蔗渣方面，其他酶类也有一定效果。田世杰等利用木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶降解蔗渣中木质素，发现能降解18.46%木质素，从而提高纤维素酶水解率28.67%。同时确定酶解最适条件为温度40℃，pH=4.0，反应48 h[40]。杨慧敏在其课题研究中指出处理蔗渣时添加 0.5 mg/g的纤维素酶辅助酶AA9 (Auxiliary Activity 9)，蔗渣的酶解效率能提高 27.3%，而且还能节约至少17%纤维素酶用量[41]。有较多证据表明采用复合酶酶解蔗渣，能使蔗渣酶解糖化产物最大化水解。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶共同作用，蔗渣的水解产物均为单糖[2]。丁胜华比较了复合多糖酶Viscozyme L、木聚糖酶和纤维素酶3种酶不同组合的水解效果，发现3种复合酶的水解效果比2种复合酶和单独酶的更好[23]。浓度为80 g/L的蔗渣纤维素用 β-葡萄糖苷酶(浓度 30 CBU/L)配合纤维素酶(浓度 15 FPIU/g)处理 48 h，葡萄糖得率能达到81.58%，总糖得率 84.23%，纤维素酶解得率高达95.02%[42]。在利用蔗渣水解发酵丁二酸的研究中发现，底物浓度为75 g/L时，用纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶组成的复合酶制剂水解，产物中还原糖浓度为65.6 g/L，蔗渣总纤维素水解率高达90%[43]。张迪采用纤维素酶、果胶酶各2.0 g/L，木聚糖酶3.0 g/L，半纤维素酶5 g/L的复合酶组合酶解蔗渣，还原糖产量增加较为迅速，最终酶解液中总葡萄糖浓度为 5.99 g/L[44]。刘云云使用纤维素酶(20 FPU/g)和半纤维素酶Htec2 (1200 IU/g)处理浓度为25%(w/v)底物，反应96 h后，葡萄糖和木糖分别达到155.73 g/L、63.16 g/L，总糖量为241.91 g/L，葡聚糖和木聚糖转化率高达 98.58%和 94.87%[45]。说明复合酶组合能高效转化蔗渣，也为酶解蔗渣指明了研究方向。

5 展望

我国现有糖厂 300家以上，每年产生蔗渣约2000万 t。除少量用于造纸外，大多被直接烧掉或丢弃，利用率极低，不仅浪费资源，还导致环境污染问题。由于国家日益重视农业加工副产品的利用，蔗渣的利用也得到了一定程度的发展，目前蔗渣在造纸、发电、饲料、栽培、燃料、生产酶制剂、板材、功能性食品等领域均有一定的应用研究。蔗渣本身价格低廉、产地相对集中，收集简单，具有极大的利用空间和潜力，但规模化利用生产高附加值产品仍需理论和技术积累。

酶制剂具有特异性强、高效、操作简单、环保等优点，已广泛应用于纺织工业、食品行业、医药、化妆品、饲料加工、材料等多个领域，在制糖工业澄清工艺中也有应用。利用酶制剂处理蔗渣可以提高甘蔗的全生物量利用率，增加产品附加值，提高转化率，增加经济效益，降低能耗和污染，具有非常重大的意义。由于蔗渣本身的半纤维素和木质素形成牢固的结合层包裹着纤维素，尤其是木质素的存在严重阻碍了酶制剂与纤维素的接触，单一酶类直接酶解效率不高，一般需要多种酶协同水解才能提高水解率和产物得率，获得较好效果。另一方面，蔗渣的纤维素对纤维素酶等有较强的吸附作用，导致酶解工艺中酶的消耗量过高，成本增加。因此要加大复合酶制剂和酶回收再利用技术的研制力度，从而使蔗渣利用真正达到高效低成本高效益。相信经过广大科研工作者及糖厂技术人员的共同努力，酶制剂的使用一定会使我国蔗渣的高值化利用取得长足进步。