脉络膜新生血管相关信号通路研究进展

邓宝娣，李 嘉，王庭槐

0引言

脉络膜新生血管(choroid neovascularization，CNV)又称视网膜下新生血管，是年龄相关性黄斑变性[1-2]、病理性近视[3]、中心性渗出性脉络膜视网膜病变[4]、息肉状脉络膜血管病变[5]、特发性脉络膜新生血管[6]、眼组织胞浆菌病综合征[7]等多种眼内疾病的基本病理改变，常累及黄斑，导致中心视力的严重损害。随着眼底荧光素血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)、吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography，ICGA)及光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)的广泛应用，人们认识到CNV是多种眼底病的重要病理现象[8-9]。CNV来自脉络膜毛细血管，经Bruch膜(Bruch’s membrane，BrM)入侵视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)层和Brush膜，因新生血管结构不完整，渗漏的液体积聚在RPE层和视网膜之间，使感光细胞与RPE层分离，最终导致失明[10]。目前对CNV的研究多与视网膜新生血管交叉，但是与视网膜新生血管不同，单纯在RPE表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的转基因小鼠不足以诱发CNV，需要视网膜下注射操作产生的炎症反应才能实现[11]，且二者在病理学上也有很多不同之处。因此，进一步研究CNV的发生发展机制对其诊疗具有重要意义。目前研究报道的与CNV相关的信号通路主要包括5条，分别为VEGF信号通路、Wnt信号通路、Shh(sonic hedgehog)信号通路、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β/Smad信号通路和Notch信号通路。下面我们将分别阐述这5条信号通路在CNV发生发展中的研究进展。

1 VEGF信号通路

VEGF作为强大的促血管生成因子，其在各类新生血管性疾病包括各种眼底血管疾病、肿瘤、伤口愈合等过程中的作用已有大量研究，其中以VEGF-A/VEGFR-2信号通路研究最多[12]。关于CNV的研究也以VEGF-A信号通路研究为主[13]。VEGF-A与其受体结合后，可调节血管内皮细胞，促进血管生成并增加血管通透性，因此VEGF-A及其受体也是CNV治疗的靶分子。经典的VEGF通路为VEGF-A与VEGFR-2相连后，形成二聚体，并激活受体激酶活性，从而催化受体自体磷酸化。磷酸化后的受体反过来可募集相关蛋白并激活多种胞内信号通路，如Y1175残基磷酸化可诱导磷脂酶(phospholipase，PLC)γ-依赖的钙离子动员和激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，进而激活丝裂原活化蛋白激酶通路，导致细胞持续增殖[12]。目前，玻璃体内注射抗VEGF单克隆抗体仍是治疗CNV的主要方法，然而仍有高于60%的年龄相关性黄斑变性患者接受此治疗后视力情况并未改善[14]，因此，在研究CNV具体发生发展机制以及研发更有效的治疗方式或者药物时，仅仅局限于VEGF信号通路是远远不够的。

2经典Wnt信号通路

Wnt是一类富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，与卷曲蛋白(frizzled，Fz)受体或Fz/低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)共受体结合，从而调节众多靶基因的表达。当Wnt与LRP5/6共受体结合，可保护转录因子β-连环蛋白(β-catenin)免受磷酸化降解，进而β-catenin在胞内蓄积，β-catenin转位至核内从而调节包括VEGF在内的靶基因的表达。如Wnt缺失，β-catenin则会由含糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinases-3β，GSK-3β)的蛋白复合物磷酸化降解[15]。研究发现，Wnt信号通路与活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)信号通路间可能存在恶性循环调节机制，加重CNV形成[16]。Wnt信号通路还可增强核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路的免疫反应，加重CNV进展[17]。在渗出型年龄相关性黄斑变性，上调Wnt信号通路可激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路，进而激活氧诱导因子-α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)信号通路，HIF-α可激活葡萄糖转运蛋白(glucose transport albumen，Glut)、己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase-A，LDH-A)、单羧酸转运蛋白-1(monocarboxylate transporter-1，MCT-1)等糖酵解酶，引发有氧糖酵解，使视网膜内皮细胞胞内产生过多乳酸，进而激活VEGF活性，形成CNV[17]。最新一项体外人脐静脉实验发现，Wnt/β-catenin信号通路通过氧化应激介导了氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)引起的人脐静脉内皮细胞损伤[18]。鉴于Wnt信号通路在CNV发生发展过程中扮演与多通路交互作用的角色，其特异性阻断剂能否有效抑制人CNV进展甚至使已有的损伤好转，亟需进一步的临床试验加以验证。

3 Shh信号通路

哺乳动物体内含有3种Hh(hedgehog)基因：Shh、Ihh(indian hedgehog)、Dhh(desert hedgehog)[19]。其中，Shh是发育过程中一个强大的血管生成因子[19]，癌症发生过程中表达升高[13]。Hedgehog信号通路主要由信号分子Hh、膜受体修补蛋白(patched，Ptc)、Smo(smoothened)以及某些中间信号转导分子和核转录因子翅脉中断基因(cubitus interruptus，Ci)/胶质瘤相关原癌基因同源物(glioma-associated oncogene homoglog，Gli)等组成[20]。Hedgehog信号通路为配体Shh与Ptc受体结合后，Ptc解除对Smo的抑制，Smo的C-末端进而被蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)、G蛋白偶联受体2(G protein-coupled receptor kinase 2，Gprk2)等激酶磷酸化激活，促使Smo在纤毛内聚集并打开构象，进而与埃利伟氏综合症基因(Ellis-van Creveld/Ellis-van Creveld-2，Evc/Evc2)结合形成Smo/Evc/Evc2复合物，驱动蛋白家族成员7(kinesin-like protein family member 7，KIF7)受Hh募集并激活此复合物，从而募集激酶磷酸化Gli蛋白，磷酸化的Gli易位到细胞核中，激活Shh靶基因[21]。最初发现Hedgehog可能与CNV相关是因为一项全基因组关联分析发现Shh信号通路元件Gli2和Gli3与年龄相关性黄斑变性密切相关[22]。最新研究发现，Shh信号通路与年龄相关性黄斑变性中CNV密切相关，用环巴胺(cyclopamine)抑制Shh信号通路可减小激光诱导的CNV损伤，而用其激活剂purmorphamine可使新生血管面积显著增大[19，23]，且Shh通路是通过上调下游的HIF-1α-VEGF-delta样配体4(delta-like ligand 4，DLL4)级联反应起作用的[23]。可见Shh信号通路在CNV形成过程中的作用同样不容小觑，其调节HIF-1α-VEGF信号通路的具体机制还需进一步探究。

4 TGF-β/Smad信号通路

TGF-β是一种多效细胞因子，其介导的信号通路参与细胞增殖、分化、血管生成、神经元生长、炎症、纤维化过程和免疫监测等[14]。目前发现的TGF-β有6种类型异构体，而哺乳动物中则有TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3三个亚型，其体外性质类似，但体内效应不同[24]。TGF-β有Ⅰ型和Ⅱ型两个重要的受体[25]。成熟的TGF-β1在发挥作用时首先与TRⅡ结合，诱导其磷酸化再与TR I结合形成二聚体复合物，该复合物可使调节受体的Smads蛋白(Smad2和Smad3)磷酸化，磷酸化后的Smads蛋白与结合型Smads蛋白(Smad4)结合为Smads复合物并移位至细胞核，再与其它转录因子共同调节靶基因的转录[14]。多项研究发现，在激光光凝诱导的鼠CNV模型中，TGF-β/Smad信号通路通过调节促血管生长因子肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、VEGF的表达在CNV的进展中发挥重要作用，而特异性TGF-β均能有效抑制CNV的形成[14，24]。然而，有学者则发现，TGF-β具备稳定脉络膜和视网膜血管的作用，特异性阻断其在眼内血管内皮细胞上的主要信号通路，足以诱发CNV[25]。考虑到前两者用的TGF-β抑制剂为对TRⅠ具特异性抑制作用或对TGF-β各种亚型均具有特异性抑制作用，而后者则特异性敲除TRⅡ，我们猜想，TRⅠ在CNV的形成中起促进作用，而TRⅡ在血管正常更新中起重要作用，从而导致抑制不同的TR出现相反的作用。然而，其具体作用机制及此说法是否成立，还需进一步研究加以验证。

5 Notch信号通路

Notch信号的传递可在多种过程中发挥调节作用，如血管发生、肌发生、神经生成和发生及造血等过程，并且决定不同组织中各种细胞类型的生长、分化和存活[26]。Notch信号通路的激活有两种方式：Notch经典传导途径和CSL[DNA结合蛋白在哺乳动物、果蝇、线虫的名称分别为C-启动子结合蛋白-1(C-promoter binding protein-1，CBF-1)、无毛抑制因子(suppressor of hairless，SuH)及Lag-1，合称CSL]非依赖途径，体内以经典传导途径为主[27]。Notch配体与其受体的细胞外结构域结合，在γ-分泌酶依赖性蛋白水解酶作用下裂解释放Notch细胞内结构域入核，随后Notch1与CSL结合并将其转录抑制因子转化为转录激活物复合体，从而作用于下游靶基因[28]。近年研究发现，Notch信号在血管生成中扮演重要角色，在内皮细胞增殖、迁移、血管分化和血管形成等过程中发挥重要作用[29]。多项研究发现，Notch信号通路可负向调控病理性眼的血管生成，而减弱Notch信号通路可加重CNV带来的损伤[27，30]。然而根据最新研究报道，敲除骨髓细胞中的Notch信号通路可抑制激光损伤后视网膜和脉络膜中的早期炎症反应，减少脉络膜中Arg1阳性单核细胞在脉络膜中的聚集，从而抑制VEGF和TNF-α的产生，进而抑制CNV的形成[26]，这一截然相反的结果，可能是由于不同的细胞类型中Notch信号通路对CNV形成与发展具有不同的作用。因此，需进一步明确Notch信号通路在CNV发生发展中的作用，有利于我们深入理解CNV中免疫反应与新生血管形成的交互作用。

6其它相关影响因子

近年来，炎症反应在CNV发生发展中的作用引起人们的关注。有研究报道表达于CNV内皮细胞上的γ干扰素诱导蛋白(interferon-γ inducible protein 10，IP-10)/CXC趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3，CXCR3)信号通路具有抑制CNV的作用，其机制可能与IP-10/CXCR3信号通路影响病灶部位炎症反应相关[31]。而最新的一项临床试验显示湿性年龄相关性黄斑变性患者眼内IP-10水平明显较白内障患者高，玻璃体腔注射阿柏西普(afibercept)后，IP-10的水平进一步升高[32]，证实了IP-10在CNV发生发展中起抗新生血管作用的假设。此外，基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2，MMP-2)[33-34]、Toll受体(toll-like receptors，TLRs)[35]、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)[36]等因子在CNV中的作用也有报道，阐明上述因子与CNV的关系将有助于加深我们对CNV的理解。

7展望

了解上述信号通路在其它生理病理过程中的交互作用，也能给CNV的研究带来一定的启发。研究表明，在大肠肿瘤中Wnt信号通路可以上调VEGF表达[37]，间质间充质细胞中的Shh信号通路可上调VEGF表达[38]，两者均有促进VEGF信号通路的作用，且在膀胱上皮干细胞中Shh信号通路通过上调基质中Wnt信号通路诱导尿路上皮细胞和基质细胞的增殖[39]，那么在新生血管形成中，Shh信号通路是否通过上调Wnt信号通路从而调控VEGF信号通路？如是，其关键分子又是哪一个？另外，在自身免疫性心肌炎研究中，TGF-β可通过诱导Wnt蛋白的分泌从而激活Wnt信号通路[40]，而TGF-β介导的上皮细胞向间充质细胞转化需要Notch信号通路的参与[41]，Notch信号通路调控血管分支形成的作用也需要有TGF-β信号通路参与[42]。另有研究报道肝嗜铬细胞中的Wnt信号通路通过上调锯齿状蛋白1(jagged1b，jag1b)和锯齿状蛋白2(jagged2b，jag2b)表达进而调控胆管上皮细胞中Notch信号活性[43]，那么TGF-β信号通路是否可能通过Wnt信号通路正反馈Notch信号通路，抑或只是不同组织细胞间不同信号通路竞争拮抗作用？若这些信号通路间相互作用的分子机制得以阐明，将有助于我们进一步加深对CNV及其它新生血管性疾病发病机制的认识。

综上所述，CNV的形成是多条信号通路包括促血管生成因子、抑制血管生成因子及炎症因子等共同作用的结果，因此在CNV机制的研究过程中，不应只考虑促进新生血管形成的相关信号通路，而应考虑到其它一些信号通路的参与，如抑制新生血管的信号通路及免疫相关信号通路等，这些通路交互联系的作用同样在CNV的发生发展过程中具有重要作用，从而拓宽我们对CNV的认识。然而，目前大多数关于CNV治疗方案的研究多数是在改进抗VEGF治疗的给药方式或者研发新型抗VEGF药物[44-45]，各通路在CNV的具体作用尚未明确。在以后的研究中仍需要进一步阐明这些信号通路在CNV发生发展过程中的具体作用，从而为研制治疗CNV相关性疾病长期有效的防治方式提供思路。