尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分抗炎作用研究

文 乐，李 波，朱继孝，钟国跃，王洪玲*，陈 影，张梓杰，李 星，蒋 坤

(1.江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，江西南昌 330004；2.贵州百灵企业集团制药股份有限公司，贵州安顺561000)

尼泊尔酸模(RumexnepalensisSpreng.)为蓼科酸模属多年生草本植物，主要产于西南部、甘肃南部、青海西南部等地区，具有止血、止痛的功效[1]。尼泊尔酸模在贵州民间作为土大黄基原品种之一，收录于2003版《贵州省中药材、民族药材质量标准》里，具有清热解毒、杀虫的功效，用于治疗肝炎及各种炎症、目赤、便秘等[2]，其化学成分主要包括蒽醌类、黄酮类等化合物[3-6]，但其抗炎药效物质尚不清楚。基于此，笔者以尼泊尔酸模为研究对象，结合二甲苯致小鼠肿胀模型和角叉菜胶致大鼠足肿胀模型筛选其有效部位，并对有效部位进行化学成分研究，找到其活性成分，为土大黄的质量标准研究提供一定的化学和药理学方面的依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物。210只SD大鼠，雄性SPF级，体重(200±20)g，200只昆明种小鼠，雄性SPF级，体重(20±2)g，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK(湘)2016-0002。

1.1.2试剂及药物配制。尼泊尔酸模由贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供，经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为尼泊尔酸模(RumexnepalensisSpreng.)。王洪玲等[7]对尼泊尔酸模进行提取和分离，从中得到4个部位[水部位(RNS1，898 g)、30%乙醇部位(RNS2，77 g)、50%乙醇部位(RNS3，32 g)、90%乙醇部位(RNS4，23 g)]和5个单体化合物[大黄素(emodin，1)、大黄酚(chrysophanol，2)、大黄素甲醚(physcion，3)、大黄酸(rhein，4)、白藜芦醇(resveratrol，5)]。此外，从90%乙醇部位也分离得到化合物1 和3。总蛋白试剂盒(批号20170309)、超氧化物歧化酶试剂盒(批号20170612)、丙二醛试剂盒(批号20170613)购买于南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α试剂盒(批号20170602)、大鼠IL-1β ELISA试剂盒(批号20170602)购买于欣博盛生物科技有限公司；阿司匹林肠溶片(批号161208)购买于大同市利群药业有限公司；二甲苯(分析纯)、冰醋酸(分析纯)购买于国药集团；角叉菜胶(批号1408463)购买于西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.1.3仪器。Beckman ALLegra64R高速冷冻离心机(美国曼库尔特公司)；AU400全自动生化分析仪(日本Olympus光学株式会社)；UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；Forma -86 ℃ 超低温冰箱(美国Thermo集团)；Multiskan GO全波长酶标仪(美国Thermo公司)；DY89-Ⅱ 电动匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响。200只小鼠随机分为20组，每组10只，分别为模型组、阿司匹林阳性对照组，RNS1低、高剂量组，RNS2低、高剂量组，RNS3低、高剂量组，RNS4低、高剂量组，emodin低、高剂量组，chrysophanol低、高剂量组，rhein低、高剂量组和resveratrol低、高剂量组，不同部位提取物剂量设计按《贵州省中药材、民族药质量标准》[2]规定人用剂量每天9 g，根据体表面积换算为小鼠1.17 g/kg，高剂量为低剂量的2倍，即2.34 g/kg，5种单体化合物参照常用剂量设置化合物低、高剂量分别为50、100 mg/kg。参照文献[8]设定阿司匹林小鼠剂量为0.2 g/kg。模型组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃阿司匹林药液，各药物组灌胃相应的药液，连续给药5 d，于末次给药后30 min后，用二甲苯30 μL均匀涂抹每只鼠右耳两面致炎，左耳作为对照。致炎后30 min脱颈椎处死小鼠，以8 mm 直径打孔器取下耳缘左、右耳片，称量质量，以右、左耳片重量差表示肿胀度，并计算肿胀抑制率。肿胀度(mg)=右耳耳片质量(mg)-左耳耳片质量(mg)；肿胀抑制率=[(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度]× 100%。

1.2.2尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响。210只大鼠，分别为正常组、模型组、阿司匹林阳性对照组、不同部位提取物及5种化合物低、高剂量组，提取物给药剂量根据人用剂量和体表面积换算为大鼠0.81 g/kg，高剂量为低剂量的2倍，即1.62 g/kg，化合物低、高剂量分别为50、100 mg/kg。连续给药5 d，末次给药后测定右足趾致炎前的体积，末次给药后30 min，在各组大鼠的右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL致炎，在致炎后3 h用足容积测量器测定右足趾致炎后的体积，以致炎前后体积差为足趾肿胀度。按公式计算足跖肿胀度：足跖肿胀度=(致炎后足容积-致炎前足容积)/致炎前足容积×100%。

同时5种单体化合物组的大鼠摘眼球取血后全血3 000 r/min离心 5 min，取上层血清置于 4 ℃冰箱中冷藏备用，按照试剂盒说明书对血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)进行测定。脱颈处死大鼠，并剪下大鼠炎症右后足，称重，以预冷的生理盐水为匀浆介质，制备成10%的组织匀浆，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，将离心好的匀浆留上清，待用。TNF-α、IL-1β等指标的测定均按照试剂盒说明书操作。

2 结果与分析

2.1尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响试验结果表明(图1)，与模型组相比，阿司匹林组和RNS2、RNS3高剂量组小鼠耳肿胀度有显著降低(P<0.05)；5种单体化合物除了rhein的低剂量组对小鼠耳肿胀没有抑制作用，其他各给药组小鼠耳肿胀度均显著降低，且以高剂量组对小鼠耳肿胀抑制作用较好，其中emodin、chrysophanol的高剂量组效果与阿司匹林组相当。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01Note：Compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01图1 尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响Fig.1 Effect of extracts from different parts of Rumex nepalensis and five main components on xylene-induced ear swelling in mice

2.2尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响由图2可知，与模型组相比，阿司匹林组和RNS2、RNS3高剂量组可抑制大鼠足肿胀度(P<0.05)；emodin的高剂量组以及chrysophanol、physcion的低、高剂量大鼠足肿胀度明显降低(P<0.05)。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01Note：Compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01图2 尼泊尔酸模不同部位提取物及5种主要成分对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响Fig.2 Effect of extracts from different parts of Rumex nepalensis and five main components on rat paw swelling caused by carrageenan

2.3尼泊尔酸模中5种主要成分对角叉菜胶致大鼠足肿胀组织炎浆的TNF-α和IL-1β含量影响由图3可知，与正常组大鼠相比，模型组大鼠的TNF-α和IL-1β显著升高(P<0.01)，说明造模成功。与模型组相比，emodin、chrysophanol、physcion和rhein低、高剂量大鼠组织炎浆中的TNF-α显著降低；但是仅有emodin、chrysophanol、physcion的高剂量IL-1β有所降低(P<0.05)。

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01Note：Compared with the normal group，#P<0.05，##P<0.01；compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01图3 尼泊尔酸模中5种主要成分对角叉菜胶致大鼠足肿胀及组织炎浆中的TNF-α(a)和IL-1β(b)含量的影响Fig.3 Effect of five main components in Rumex nepalensis on the content of TNF-α(3A)and IL-1β(3B)in rat paw swelling and tissue inflammatory pulp caused by carrageenan

2.4尼泊尔酸模中5种主要成分对角叉菜胶致大鼠足肿胀大鼠血清SOD和MDA含量的影响由表1可知，与模型组相比，除resveratrol低剂量组外，5种主要成分各给药组血清中MDA含量显著降低，其中emodin的高剂量，physcion和rhein的低、高剂量组优于阿司匹林组。此外，仅physcion的低、高剂量以及rhein、resveratrol的高剂量组大鼠血清中SOD活性升高(P<0.05)。

表1尼泊尔酸模中5种主要成分对角叉菜胶致足肿胀大鼠血清中SOD和MDA含量的影响

Table1EffectsoffivemaincomponentsinRumexnepalensisonthecontentsofserumSODandMDAinratswithcarrageenan-inducedfootswelling

组别Group剂量Dosagemg/kgSODU/mLMDAnmol/mL正常组Normal group—314.94±44.583.91±0.57模型组Model group—228.17±11.99#7.59±0.88##阿司匹林组Aspirin group200266.27±42.815.04±0.48∗∗emodin50299.56±28.525.14±0.52∗∗100268.11±16.843.50±0.35∗∗chrysophanol50263.57±15.925.06±0.35∗∗100258.98±10.866.16±0.24∗physcion50347.69±36.52∗∗3.61±0.20∗∗100328.70±27.85∗4.61±0.33∗∗rhein50267.64±44.043.45±0.28∗∗100467.43±41.95∗∗4.41±0.14∗∗resveratrol50217.77±18.957.57±0.45100451.74±29.45∗∗5.27±0.26∗∗

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note：Compared with the normal group，#P<0.05，##P<0.01；compared with the model group，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论与结论

该试验首次通过建立二甲苯致小鼠肿胀模型和角叉菜胶致大鼠足肿胀模型筛选尼泊尔酸模的有效部位，结果表明30%乙醇部位(RNS2)、50%乙醇部位(RNS3)是其活性部位。

土大黄中含有较多的游离蒽醌类成分，如大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等[9]。王洪玲等[7]通过对有效部位的分离纯化，获得了5个量大化合物，即大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸和白藜芦醇。其中大黄素在体外对巨噬细胞产生的多种炎症细胞因子有调节作用[10]，对急性胰腺炎有抗炎作用[11]。大黄酚能改善脑缺血/再灌注小鼠记忆功能[12]，对小鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用[13]；对大黄素甲醚的药理作用主要集中在缺血、缺氧脑损伤或缺血-再灌注脑损伤的神经保护作用等方面；大黄酸对糖尿病有治疗作用，并对细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应具有一定的抑制作用[14]；白藜芦醇具有降血尿酸、抗炎等作用[15]。这些成分虽大多曾有报道过其体内(外)抗炎活性，但未见报道哪个(或哪些)成分为尼泊尔酸模抗炎的主要活性成分。该研究对30%和50%乙醇部位含量较大的化学成分进行活性筛选，结果表明同等剂量条件下，大黄素、大黄酚和大黄素甲醚抗炎活性较强，且其在药材中含量较高，可能为其主要活性成分；对角叉菜胶致大鼠足肿胀组织炎浆生化指标的检测结果表明其抗炎的作用机制可能是与抑制脂质氧化终产物MDA，以及调控TNF-α和IL-1β等炎症因子的释放有关。

此外，值得注意的是，尼泊尔酸模50%和90%乙醇部位均分离得到大黄素和大黄素甲醚，但是90%乙醇部位并未显示明显的抗炎作用，推测可能是90%乙醇部位色素较多导致大黄素和大黄素甲醚含量相对较低的原因。尼泊尔酸模具有抗炎作用，下一步将继续采用细胞和分子水平对其分离得到的化合物进行抗炎活性筛选，为以后尼泊尔酸模的开发和利用提供一定的化学和药理学基础。