接受TACE治疗的肝细胞癌患者血清miR-335水平变化及其对预后判断的价值分析*

张小舟，帅领，王庆大，杨楠

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是位居世界第五，我国第三位的恶性肿瘤，严重威胁着人们的生命健康。全世界每年大约有50～100万人因肝癌而死亡，而其死亡率还在逐年上升，总体预后较差[1]。为提高患者生存率，避免错失最佳治疗时机，早期诊断尤为重要。现阶段，对HCC的筛查及监测主要依赖于实验室检查指标，例如血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、γ-谷氨酰转肽酶（γglutamyl transpeptidase，GGT），以及影像学方法，例如腹部B超、MRI、CT等[2]，但影像学检查不易早期发现肿瘤，且在肝硬化患者，小病灶往往难于与肝硬化结节相鉴别。近期有研究表明[3]，miRNAs在HCC的发生发展过程中发挥着重要的作用，可能直接参与了癌变过程中的细胞增殖、分化、凋亡、侵袭等。有关学者[4]研究了HCC患者血清miR-16、miR-15b、miR-130b、miR-195、miR-199a 等水平变化及其临床意义，但关于miR-335与肝癌关系的研究还较少。本研究主要探讨了HCC患者血清miR-335水平的变化，并分析了应用 miR-335早期诊断HCC的可能性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年5月～2016年5月我科收治的HCC患者60例，男42例，女18例；年龄38～70岁，平均年龄（56.3±18.5）岁。符合中华人民共和国原卫生部发布的原发性肝癌诊疗规范的诊断标准。根据2010年国际抗癌协会（International Union Against Cancer，UICC）关于 HCC TNM 分期标准，Ⅰ/Ⅱ期41例，Ⅲ/Ⅳ期19例。排除标准：①入院时肝功能存在严重障碍；②合并其他系统肿瘤或肿瘤远处转移者。慢性乙型肝炎患50例，男33例，女17例；年龄 33～60岁，平均年龄（40.1±16.1）岁；乙型肝炎肝硬化患者50例，男36例，女14例；年龄38～64岁，平均年龄（50.1±14.2）岁。另选择同时期健康体检者50例，男35例，女15例；年龄36～69岁，平均年龄（55.1±12.3）岁。

1.2 血清miR-335检测 清晨，采集外周静脉血4 ml，置于真空试管，室温下静置1～2 h，4000 r/m离心10 min，使用移液器小心吸取上清液，移入1.5 ml无菌无RNA酶的EP管中，贮存于-80℃冰箱保存，备用。取出血清，置于37℃水浴锅中加热溶解，吸取血清200μl，根据血清RNA提取试剂盒（购自QIAGEN公司）说明书方法提取血清RNA，并测定总RNA浓度和纯度。根据逆转录试剂盒（购自QIAGEN公司）操作说明书，构建20 μl反应体系，在Gene AmpPCR System 9700进行逆转录，设定程序：37℃ 60 min，95℃ 5 min。PCR试剂盒购自锐博生物，根据操作说明书配制20 μl反应体系，采用标准的三步法，预变性：95℃ 20 s，95℃10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40个循环。根据公式2-△△Ct，计算血清 miR-335 水平。

1.3 肝动脉化疗栓塞术（TACE）治疗 对所有HCC患者行TACE治疗，平均每例患者介入治疗3.1次，并随访24个月。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，采用独立样本t检验，计数资料以n（%）表示，采用x2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。取灵敏度与特异度之和最大为最优诊断截断点，计算受试者工作特征（ROC）曲线下面积（area under the curve，AUC），分析血清miR-335预测HCC患者预后的价值。

2 结果

2.1 各组血清miR-335水平比较 HCC患者血清miR-335水平显著低于乙型肝炎和肝硬化患者，也显著低于正常人（P=0.001）；肝硬化和慢性乙型肝炎患者血清miR-335水平与正常人比，差异均无统计学意义（P＞0.05，表 1）。

表1 各组血清miR-335水平（±s）比较

表1 各组血清miR-335水平（±s）比较

与正常人比，①P＜0.05；与肝癌组比，②P＜0.05

例数 血清miR-335水平肝癌 60 1.18±1.35①肝硬化 50 1.91±2.11②乙型肝炎 50 2.01±0.75②正常人 50 2.07±1.25

2.2 不同临床和病理学特征HCC患者血清miR-335水平比较 存在门静脉癌栓的HCC患者血清miR-335 水平显著低于无癌栓患者（t=4.586，P＜0.001），死亡患者血清miR-335水平显著低于生存患者（t=3.324，P＜0.001），而不同性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、有无淋巴结转移和血清AFP水平高低患者，血清miR-335水平差异无统计学意义（P均＞0.05，表 2）。

2.3 血清miR-335水平对HCC患者预后的判断价值 本组HCC患者经TACE治疗后，随访2年，死亡13例（21.7%）。以血清miR-335水平小于或等于0.820为截断点，判断患者2年内死亡的敏感性为83.0%，特异度为 100.0%（图 1）。

表2 不同临床和病理学特征HCC患者血清miR-335水平（±s）比较

表2 不同临床和病理学特征HCC患者血清miR-335水平（±s）比较

例数 血清miR-335 t值 P值性别 男 42 1.12±1.27 1.16 0.251女 18 1.24±1.32年龄（岁） ≤56 38 1.08±1.16 1.471 0.147＞56 22 1.18±1.44肿瘤直径（cm） ＞3 32 1.15±1.57 0.62 0.537≤3 28 1.24±0.92 TNM分期 Ⅰ/Ⅱ期 41 1.11±1.47 0.545 0.588Ⅲ/Ⅳ期 19 1.21±0.91淋巴结转移 无 45 1.11±0.94 0.19 0.85有 15 1.25±1.37癌栓 无 38 2.55±1.81 4.586 ＜0.001有 22 0.71±0.65血清AFP（μg/l） ≤20 28 1.15±1.31 0.61 0.545＞20 32 1.25±1.23预后 生存 47 1.19±10.83 0.179 0.039死亡 13 0.65±0.74

图1 血清miR-335水平判断HCC患者预后的受试者工作特征曲线

3 讨论

HCC位居世界第五大常见肿瘤，80%～90%HCC患者主要是因为HBV和丙型肝炎病毒（HCV）感染引发的。因为HCC发病隐匿，病情进展迅速，当患者确诊时大多已经处于疾病的中、晚期，错过了手术时机，即使行切除术后也很容易复发，5 a生存率低于10%。早期诊断的HCC患者，尤其是肿瘤直径小于 2 cm的单结节肿瘤，其术后5 a生存率大约为70%。所以，尽早诊断对于后续的治疗和改善预后十分重要。现阶段，用于HCC筛查及监测的主要方法是在影像学检查的基础上联合实验室检查。影像学检查在辨别早期肿瘤与良性病变，特别是直径小于1 cm的HCC，CT和MRI检查存在局限性。对于早期小病灶，细针穿刺也不容易成功，阴性结果可能还会造成漏诊而失去早期发现肿瘤的机会。

miRNA是高度保守的非编码单链小分子RNA，成熟miRNA与目的基因mRNA互补结合，导致mRNA降解或抑制其翻译，可精细调控基因的表达[5]。近年来，人们越来越关注循环系统存在的miRNAs与HCC等肿瘤的关系，miRNAs作为基因调控分子在肿瘤的诊断、治疗及预后方面的应用前景广阔[6，7]。采集血液，检测外周血 miRNAs，方法简单、方便，更容易被患者及临床医生所接受[8]。此外，miRNA具有非常强的稳定性，常温放置超过24 h、反复冻融、强酸强碱等极端条件都不影响其稳定性[9，10]。国外学者研究表明，HCC 癌组织 miR-21[11]、miR-224[12]水平上升，而在术后却明显下降，并且这些循环miRNA水平与肿瘤淋巴结转移、临床分期存在相关性，提示其可能与患者预后有关。同时，这类miRNAs具有促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力。但是，miRNA功能多样，部分miRNAs可导致肿瘤细胞生长抑制、侵袭力减弱，如在HCC癌组织miR-101[13]和miR-145[14]水平降低。把这些miRNA前体转染至HCC细胞株，可发现HCC细胞生长受抑、且呈剂量依赖性，细胞凋亡增加。miRNAs参与了HCC的发生和发展过程，其在HCC早期诊断和疗效观察中可能具有良好的应用前景。

相关研究显示，多种肿瘤患者血清miR-335水平降低。通过实时定量逆转录PCR法检测发现，前列腺癌组织miR-335水平较癌旁良性前列腺组织明显降低，提示这种miRNAs的丢失可能与前列腺癌的临床发展有重要联系[15]。肾透明细胞癌组织miR-155明显下调，而且miR-155水平与肾透明细胞癌的大小呈正相关，说明miR-155可作为肾癌潜在的生物标志物[16]。在HCC患者，也有学者发现肿瘤组织miR-155水平显著下降，尤其是伴有远处转移的HCC患者，其血清miR-155水平下降幅度更大[17]。可以看出，肿瘤患者血清不同miRNA水平变化差异较大。

本研究采用实时荧光定量反转录PCR法检测了肝癌、乙型肝炎和肝硬化患者及正常对照组血清miR-335水平，结果显示肝癌组血清miR-335水平较正常对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），也显著低于CHB和肝硬化患者，说明miR-335水平在HCC患者异常下调，作为HCC潜在的生物标志物，可以辅助诊断早期无症状的HCC患者。通过对不同临床和病理学特征的HCC患者血清miR-335水平比较发现，存在门静脉癌栓患者血清miR-335水平显著降低，死亡患者血清miR-335水平也显著降低，说明血清miR-335水平过低，预示预后不良。可能是因为miR-335的低水平促使了癌细胞的生长发育，侵袭血管，以至于血管功能和血液循环障碍，进而形成癌栓[18-20]。血清miR-335水平在不同性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、有无淋巴结转移患者之间，差异无统计学意义（P均＞0.05）。

现阶段，虽然血清AFP是国际上公认的HCC肿瘤标志物，大多数临床医师已习惯应用血清AFP诊断肝癌。然而，在诊断HCC方面的灵敏度大约为45%～70%，特异性为75%～95%，因为血清AFP水平在慢性肝炎和肝硬化患者也会升高，混淆了诊断[21，22]。本研究通过ROC曲线分析发现，应用血清miR-335水平判断接受TACE治疗的HCC患者2年内死亡的灵敏度和特异性均较好，值得进一步研究。