达乌里胡枝子没食子酸提取条件的优化

赵宇星，李小鹏，任 敏，赵 祥

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

植物酚类物质是由植物的次生代谢途径产生的，其在植物体内分布广泛、种类繁多，但是对植物的初级生产没有直接影响，而是作为一种次生防御物质发挥着重要的作用[1]。酚类物质是植物体内普遍存在的次生代谢物，广泛存在于植物的叶、根、皮、花和果实中[2]。酚酸类物质对多种植物病原真菌均可抑制活性[3]。达乌里胡枝子（Lespedeza davurica）是豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionatae）胡枝子属（Lespedza Michx.）的喜暖旱中生半灌木，其含有丰富的酚类物质[4]，干旱胁迫能够显著提高达乌里胡枝子的抗氧化能力[5]。没食子酸（Gallic acid，GA）又称五倍子酸，是一种天然酚类化合物[6]，能够抗菌、抗突变、消除自由基[7]。因此，没食子酸在提高植物适应极端环境方面发挥着重要作用。

目前，胡枝子属植物不仅被广泛用于各种动物的饲草，而且在药用领域也有着广泛的应用[8]；已从达乌里胡枝子中分离鉴定了香叶木素、山奈酚、柽柳素、木犀草素、槲皮素等11种化合物[4]。达乌里胡枝子的研究多集中在自然状态下胡枝子体内的单宁含量，但是对达乌里胡枝子酚类次生代谢物质的研究较少。

本试验以达乌里胡枝子为对象，研究了其没食子酸最佳的提取工艺及其最优测定条件，旨在为达乌里胡枝子没食子酸的提取和利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为晋农1号达乌里胡枝子，由山西农业大学牧站草学实验室种子资源库提供。没食子酸标准品（99%），来源于北京索莱宝公司。

1.2 试验设计

试验采用盆栽方式，于2016年4月1日在山西农业大学草业科学系温室中进行，平均温度为14.5～29.5℃，相对湿度为64%～79%。土壤来源于试验田用地过筛耕层土（0～20 cm），与细沙2∶1混合，pH值为7.5，并测得田间最大持水量约为24%。

试验采用上端口直径为21 cm、高26 cm的塑料桶，每桶装风干土约7.5 kg，播种量为55粒/盆。待苗齐后，每桶留苗25株。待达乌里胡枝子长到分枝期取样放置于装有冰袋的泡沫箱中，迅速带回实验室保存于超低温-80℃冰箱，以备测定。

1.2.1 达乌里胡枝子单因素提取试验 设定蒸馏水、60%甲醇、60%乙醇为提取溶剂，其他提取条件为固液比1∶40，超声时间30 min，超声温度40℃；提取溶剂浓度为20%，40%，60%，80%共4个梯度，其他提取条件为固液比1∶50，超声时间30 min，超声温度60℃；固液比为1∶30，1∶40和1∶50，其他提取条件提取溶剂为60%甲醇，超声时间30 min，超声温度60℃；测定时间为30，45，60 min，其他提取条件为提取溶剂为60%甲醇，固液比1∶40，超声温度60℃；测定温度分别设定为40，50，60，70℃，其他提取条件提取溶剂为60%的甲醇，固液比1∶40，超声时间为30 min，测定达乌里胡枝子没食子酸含量，确定单因素提取条件。

1.2.2 正交试验确定没食子酸的最佳提取条件根据单因素试验确定的因素和水平，选取溶剂浓度（A）、固液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）4个因素，采用正交表L9（34）进行试验，以确定没食子酸的最佳提取条件（表1）。

1.2.3 没食子酸含量的测定

1.2.3.1 分析样品的制备 精确称取达乌里胡枝子样品0.200 g（±0.005 g），加入有提取溶剂10 mL的具塞试管中，超声提取，超声后离心取上清液，过0.45 μm滤膜，供试验测定。

1.2.3.2 色谱条件的确定 采用Waters 1500高效液相色谱仪-2489紫外检测器测定，C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，分别选取色谱条件：甲醇-0.1%磷酸[9]（色谱条件1）；乙腈（A）-0.1%磷酸（梯度洗脱0～10 min，A 2%～10%）[10]（色谱条件2）；乙腈（A）-0.2%冰醋酸（梯度洗脱 0～10 min，A 5%～12%）[11]（色谱条件3）；乙腈（A）-0.15%三氟乙酸（梯度洗脱0～10 min，A 0%～7%）[12]（色谱条件4）；乙腈（A）-0.15%三氟乙酸（梯度洗脱0～5 min，A 0%～3%）[13]（色谱条件5），测定达乌里胡枝子没食子酸含量，以确定色谱条件。

1.2.3.3 没食子酸标准液相色谱 其色谱图如图1所示。

1.2.3.4 标准曲线的绘制 准确称取没食子酸对照品20.0mg，甲醇溶解并定容到100mL，得200μg/mL的没食子酸溶液，以此液为母液，进一步稀释成浓度梯度为 0.5，1，5，10，15，20 μg/mL 的没食子酸溶液，分别取20 μL进样于高效液相色谱仪进行测定，并且以峰面积为纵坐标，没食子酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.5 稳定性试验 精确称取达乌里胡枝子样品8份各0.200 g，按正交试验结果中最优条件进行提取，制备提取液，每隔15 min测定一份，记录数据并计算标准偏差RSD值。

1.3.6 加样回收率试验 精确称取达乌里胡枝子样品8份各0.200 g，按正交试验结果中最优条件进行提取，制备提取液，向各个样品浸提液中分别加入一定量的标样，测定含量，计算加样回收率。

1.3 数据分析

所有试验数据均采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）比较不同处理间达乌里胡枝子没食子酸含量差异显著性。使用SigmaPlot 13.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 达乌里胡枝子没食子酸最佳提取条件筛选

2.1.1 提取溶剂对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 不同提取溶剂对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响不同（图2），其中，用60%甲醇提取溶剂提取时，测得没食子酸含量最高，为7.65 mg/g；用蒸馏水溶剂提取时，测得没食子酸含量最低，为6.16mg/g。3种溶剂测得没食子酸含量由高到低顺序为60%甲醇＞60%乙醇＞蒸馏水。因此，选择60%甲醇为提取的最佳溶剂。

2.1.2 提取溶剂浓度对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 不同提取溶剂浓度对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响不同（图3），随着甲醇浓度的升高没食子酸含量表现为先升后降的变化趋势，当甲醇浓度为60%时，没食子酸含量达最大值，为9.49mg/g；当甲醇浓度超过60%时，没食子酸含量有明显降低的趋势。因此，选择60%为最佳提取溶剂浓度。

2.1.3 提取固液比对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 不同固液比对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响不同（图4），当固液比为1∶40时，没食子酸含量最高，为9.04 mg/g。因此，选择1∶40为最佳提取固液比。

2.1.4 提取时间对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 不同提取时间对达乌里胡枝子没食子酸浸出速度的影响不同（图5），当提取时间为30～45min时，达乌里胡枝子没食子酸浸出速度较快；当提取时间为45～60 min时，没食子酸含量浸出速度较慢，且在60 min时没食子酸含量达到最大值，为9.283 mg/g；当浸提时间超过60 min后，没食子酸含量开始降低。因此，选择60 min为最佳提取时间。

2.1.5 提取温度对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 不同提取温度对达乌里胡枝子没食子酸浸出速度的影响不同（图6），随着温度的升高，达乌里胡枝子没食子酸含量增加，当提取温度超过50℃时，没食子酸含量增长的幅度较大，且在60℃时达到最大值，为9.523 mg/g；60℃以后温度继续升高，没食子酸含量反而降低，且降低幅度较大。因此，选择60℃作为最佳提取温度。

2.2 高效液相色谱测定条件对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响

2.2.1 色谱条件1对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 采用甲醇和0.1%的磷酸作为流动相，甲醇与水的比例为1∶9时，没食子酸的峰与杂质峰未完全分离（图7），且洗脱出的其他杂质峰偏多，并未出现较为理想的色谱图。

2.2.2 色谱条件2对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 采用乙腈（A）与0.1%的磷酸（B）作为流动相，梯度洗脱0～10 min，A 2%～10%，体积流量1 mL/min，检测波长280 nm时，杂质峰仍然较多（图8），未得到较好的色谱图。

2.2.3 色谱条件3对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 采用乙腈（A）-2%冰醋酸（B）为流动相，梯度洗脱0～10min，A5%～12%；体积流量1mL/min，检测波长280 nm，柱温28℃，杂质峰仍然较多（图9），并未得到理想的色谱图。

2.2.4 色谱条件4对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 采用乙腈（A）和0.15%三氟乙酸（B）作为流动相，梯度洗脱0～10min，A0%～7%；10～20min，A7%～16%，体积流量1 mL/min，检测波长280 nm，柱温28℃，杂质峰明显减少，但没食子酸前后峰保留时间与没食子酸峰保留时间较近（图10），未得到较为理想的色谱图。

2.2.5 色谱条件5对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响 将色谱条件4优化后，用乙腈（A）和0.15%TFA（B）作为流动相，梯度洗脱变为 0～5 min，A 0%～3%，体积流量1 mL/min，检测波长280 nm，柱温30℃，色谱图如图11所示，得到了较好的没食子酸色谱图。

2.3 综合提取条件对达乌里胡枝子没食子酸含量的影响

通过正交试验可知，综合影响达乌里胡枝子没食子酸含量的最佳提取条件4个因素的主次顺序为A＞B＞D＞C，即提取溶剂浓度、固液比、提取温度、提取时间，A2B2C1D2为最佳提取工艺（表2）。结合单因素试验，根据没食子酸提取规律，最终选择溶剂浓度为60%甲醇，固液比为1∶40，提取时间为45 min，提取温度为60℃。在此条件下，测得达乌里胡枝子没食子酸的保留时间为2.837 min，没食子酸色谱峰的理论塔板数均不低于5 000，没食子酸与相邻色谱峰的分离度大于1.5，说明没食子酸与其他杂质色谱峰达到了基线分离（图11）。

表2 正交试验确定没食子酸最佳条件

没食子酸的峰面积（Y）与没食子酸的浓度（X）回归方程为：Y＝5.094X＋7.594 4（R2＝0.999 362），表明没食子酸在4.91～30.64 μg/mL范围内，没食子酸峰面积值与质量浓度之间呈现良好的线性关系。在 0，0.25，0.5，1，2，4，8，24 h 测得达乌里胡枝子没食子酸含量为7.30～7.73 mg/g，其RSD值为0.021%（表3），表明24 h内供试液稳定性良好。按照已知的方法对样品液制备处理，且用已知的色谱条件进行没食子酸含量的测定，最终计算出达乌里胡枝子没食子酸平均含量为7.57 mg/g，并计算回收率，结果表明，平均回收率为99.58%，RSD为0.30%（表 4）。

表3 稳定性测定结果

表4 加样回收率测定结果

3 讨论

本研究采用超声提取法对达乌里胡枝子没食子酸含量进行测定，以60%甲醇、60%乙醇、蒸馏水作为提取溶剂进行提取，结果发现，60%甲醇提取的没食子酸含量最高，并选取20%，40%，60%，80%的甲醇分别进行提取，结果表明，60%甲醇提取的没食子酸含量最高，与关潇滢等[13]和金玲等[14]以甲醇作为提取溶剂，没食子酸含量最高，稳定性最好，峰形对称，分离度好的结果一致。故选用60%甲醇作为提取溶剂。

本研究通过采用 1∶30，1∶40，1∶50的固液比分别进行提取，结果表明，固液比为1∶40时，提取的没食子酸含量最高，原因可能是由于在一定的体积范围内，增加提取液的体积可增大提取液与提取物的接触面积，使得没食子酸在甲醇中较多溶出，但随着提取液体积的增加没食子酸溶出达到饱和，再增加提取液的体积，没食子酸的溶出会减小[15]。故选取1∶40作为固液比。

本研究通过采用 30，45，60，75 min 作为提取时间分别进行提取，结果表明，60 min时，没食子酸含量最高，原因可能是由于60 min之前，没食子酸溶出不完全；当时间到达60 min时，没食子酸含量溶出达到最大值；60 min之后，随着时间的延长，没食子酸受到氧化的时间延长，没食子酸含量故而下降[16-17]。因此，选取60 min作为提取时间。

本研究通过采用40，50，60，70℃作为提取温度分别进行提取，结果表明，60℃时，没食子酸含量最高，这是由于随着温度的升高，分子热运动速度加快，渗透、扩散、溶解速度加快，使没食子酸更容易从细胞中转移到溶剂中，从而使没食子酸的含量提高；当温度上升到一定程度时，部分没食子酸可能被氧化破坏，或者由于没食子酸分子结构改变，从而使其含量下降[15]。故选取60℃作为提取的温度。

本研究通过正交试验，确定达乌里胡枝子没食子酸的最佳提取工艺，最佳提取条件为溶剂浓度为60%甲醇，固液比为1∶40，提取时间为45 min，提取温度为60℃，这与黄斌等[17]的研究结果相似。

对没食子酸对照品甲醇溶液的紫外可见光（190～600 nm）扫描发现，没食子酸在280 nm处有最大吸收波长。故选择280 nm为其检测波长。

流动相分别考察了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%冰醋酸、乙腈-0.15%三氟乙酸，结果发现，流动相为乙腈-0.15%三氟乙酸时，峰型和分离度均较好；其他条件下，杂质峰较多，且与没食子酸峰未完全分离。故选用乙腈-0.15%三氟乙酸作为流动相。

4 结论

本研究通过正交试验，得到达乌里胡枝子没食子酸最佳提取条件为溶剂浓度60%甲醇、固液比为1∶40、提取时间为45 min、提取温度为60℃，在该条件下，采用乙腈-0.15%三氟乙酸梯度洗脱，流量为1 mL/min，检测波长为280 nm，柱温30℃。结果表明，没食子酸在4.91～30.64 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，平均加样回收率为99.58%，RSD为0.30%；并且利用上述方法，测得达乌里胡枝子没食子酸含量为7.57 mg/g。