新型蒽醌类银离子荧光探针的合成、细胞成像和密度泛函理论研究

毕晶晶 李琳琳 麻娜娜 夏丁丁 仉华 张志国 刘统信 张贵生

摘 要 设计并合成了两个对称的1，2，3-三氮唑类蒽醌衍生物K1、K2， 采用1H NMR、13C NMR和HRMS表征其结构， 并考察了光谱性质。利用GaussView 9.0量化程序及含时密度泛函TD-DFT方法对K1及K1-Ag+的结构性质及理论光谱进行了计算。结果表明， 计算与测得的紫外-可见吸收光谱一致， 在370 nm左右出现蒽醌的吸收峰;荧光光谱表征实验表明，探针K1与Ag+结合后，出现两个吸收峰（466和522 nm），466 nm处荧光强度与单独K1相比增强9倍; 探针K1在H2O-DMSO （7∶1， V/V， HEPES， pH=7.4）中对Ag+具有良好的选择性识别性能， 常见共存离子及pH值对其测定无明显影响，通过Job's plot 曲线确定二者之间的结合比为1∶1，结合常数为1368 L/mol，检出限为21.2 μmol/L（S/N=3）。利用DFT方法对探针K1结构和K1-Ag+可能的络合结构进行了分子构型优化， 并计算络合物中Ag+与K1的结合能，结果表明，Ag+与两个三氮唑环和蒽醌单元络合结构结合能最大，与核磁滴定实验的结果吻合。K1和K1-Ag+的优化结构显示，K1与Ag+结合后，分子的三氮唑环发生转位， 蒽醌平面发生轻度弯曲。荧光共聚焦成像结果表明， 探针K1对Ag+有较好的选择性和灵敏度，可实现人肝癌细胞（HepG2）中微量Ag+的检测。

关键词 蒽醌;三氮唑;荧光探针;银离子;荧光成像

1 引 言

银离子（Ag+）具有杀菌、催化等特性[1，2]， 可作为抗生剂、动植物的转录抑制剂、耐质粒转变靶标等[3，4];同时，银在电子产品、摄影、影像、制药、医疗和生物学等领域应用广泛。然而，这也造成了环境中的Ag+污染，威胁人类健康，引起了广泛关注。如高浓度的Ag+可通过食物链在体内累积， 对大脑、神经和免疫系统等造成损害。另外， 由于一些含银盐药物的过度及不合理使用， 也使Ag+积聚在肝脏组织，可引起肝癌等疾病[5～8]。因此， 开发快速、灵敏的Ag+的分析检测方法具有重要意义。

目前，检测Ag+的方法包括荧光法[9，10]、电化学法[11]、比色法[12]、原子吸收法[13]和表面增强拉曼散射（SERS）[14]等。其中荧光传感方法具有简单、成本低、快速、高选择性和灵敏度等特性， 广泛用于检测阳离子、阴离子等[15，16]。近年来， 文献报道了许多检测重金属离子，如Zn2+、 Pb2+和Hg2+的新型荧光探针[17，18]， 以及检测Ag+的荧光探针， 如罗丹明、喹诺酮和BODIPY衍生物等[19，20]，然而，具有优良性能的Ag+荧光探针仍然是目前的研究热点。

蒽醌类衍生物，如阿霉素、柔红霉素等， 具有多种药理活性， 以及抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗真菌、增强免疫力等多种生物学和药学特性[21]。此外， 蒽醌类衍生物具有刚性平面结构， 并含有大环共轭体系， 具有荧光发射波长适中、光稳定性好、发光效率高的特点， 更主要的是其荧光和紫外吸收波长均出现在可见光区。因此， 它还是一类重要的染料。由于可以络合金屬离子， 氨基和羟基取代的蒽醌衍生物也被广泛用作发色团。近年来，蒽醌类荧光探针逐渐成为科研人员关注的热点[22，23]，但蒽醌衍生物荧光探针用于Ag+检测的研究尚未见报道。

1，2，3-三氮唑化合物是一类具有重要生物活性的五元氮杂环化合物， 多数基于三氮唑基团的探针主要是通过三氮唑形成一个结合口袋， 当被分析物与探针逐渐结合后， 由于荧光机制不同，如PET （光诱导电子转移）、ICT （电荷转移）等， 探针的荧光或增强或淬灭， 因此，三氮唑基荧光探针通常具有良好的选择性和强的结合能力[24，25]。本研究以具有优良生物学特性和光学特性的蒽醌为母体，设计合成了一类基于分子内电荷转移（ICT）可用于细胞成像的高选择性银离子荧光探针。利用蒽醌作为荧光团， 以1，2，3-三氮唑为结合位点， 通过Click反应合成了含有不同羟烷基链的蒽醌衍生物K1和K2， 并利用DFT理论计算等手段研究了探针K1与Ag+的络合结构和光致发光的机理，实现了对Ag+的专一性、高灵敏性检测，并可用于生物成像检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UV-2600紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）;AC400 型超导核磁共振仪 （TMS作内标，瑞士布鲁克公司）;UPLC-TQD液相色谱-串联四极杆质谱仪 （美国沃特斯公司）;F-4500 荧光分光光度计 （日本日立公司）;FV 1000激光共焦显微镜 （日本奥林巴斯公司）。

葡萄糖、溴己醇、溴丙醇、叠氮化钠、五水硫酸铜、抗坏血酸钠（北京伊诺凯科技有限公司）;三氟化硼乙醚 （分析纯，百灵威科技有限公司）;1，8-二羟基蒽醌、溴丙炔 （上海达瑞精细化学品有限公司）;金属硝酸盐与硫酸盐为结晶水合物。所用试剂均为分析纯;实验用水为二次亚沸蒸馏水。

2.2 荧光探针K1和K2的合成

银离子荧光探针K1和K2的合成路线：

2.2.1 1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2的合成[26] 将1，8-二羟基蒽醌 （2.013 g， 8.38 mmol）溶于100 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中， 加入K2CO3 （5.96 g， 42 mmol） 和3-溴-1-丙炔 （2.6 mL， 33.5 mmol）， 室温搅拌反应20 h后， 用二氯甲烷萃取，水洗涤，无水Na2SO4干燥， 过滤并浓缩， 用柱层析 （石油醚-乙酸乙酯，4∶1，V/V） 分离得到2.330 g黄色固体1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2， 产率为88%。1H NMR （400 MHz， CDCl3）： δ 7.92 （dd， J=8.0， 0.8 Hz， 2H）， 7.67 （t， J=8.0 Hz， 2H）， 7.50 （dd， J=8.4， 0.8 Hz， 2H）， 4.94 （d， J=2.4 Hz， 4H）， 2.55 （t， J=2.4 Hz， 2H）。

2.2.2 化合物 3a和3b的合成[27] 将1-溴丙醇 （2 mL， 22.3 mmol， 1.0 equiv） 溶于20 mL DMF中， 加入叠氮化钠（4.34 g， 66.9 mmol， 3.0 equiv）， 90 oC 加热搅拌。薄层色谱（TLC）监测原料反应完全后， 加入水，用二氯甲烷萃取，旋转蒸干有机相， 柱色谱分离，得到无色油状液体 1-叠氮基丙醇3a （2.1962 g， 97%）。采用同样方法制得无色油状液体 1-叠氮基己醇3b，产率为 85%。3a： 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ 3.74～3.71 （m， 2H）， 3.43 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.85～1.78 （m， 2H）。 3b： 1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ 3.64 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 3.26 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.64～1.54（m， 4H）， 1.45～1.38 （m， 4H）。

2.2.3 探针K1和探针K2的合成 将1-叠氮基丙醇3a （0.40 mL， 6.08 mmol） 和1，8-二-O-炔丙基-蒽醌1（0.50 g， 1.58 mmol） 溶于H2O-THF（1∶1，V/V）混合溶剂中，加入CuSO4·5H2O（59 mg， 0.24 mmol）和L-抗坏血酸钠盐（90 mg， 0.48 mmol）， 避光，于55℃加热搅拌下反应，产物用二氯甲烷萃取，水洗涤， 无水Na2SO4干燥， 过滤、浓缩， 用柱色谱分离（乙酸乙酯-甲醇，10∶1，V/V） ，得到黄色固体化合物K1（150 mg， 80%）。采用同样方法制备黄色固体化合物K2（产率为95%）。 Compound K1：1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.25（s， 2H）， 7.76～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.68（t， J=4.4 Hz， 2H）， 4.43（t， J=7.2 Hz， 4H）， 3.40（dd， J=10.8， 6.0 Hz， 4H）， 1.99～1.92（m， 4H）。13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ 183.2， 181.1， 157.5， 142.3， 134.2， 125.0， 123.9， 120.9， 118.8， 62.5， 57.4， 46.8， 33.0。ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C26H26N6O6Na 541.1806， found 541.1802）。Compound K2： 1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.23（s， 2H）， 7.75～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.37～4.32（m， 6H）， 3.36～3.32（m， 4H）， 1.83～1.76（m， 4H）， 1.40～1.32（m， 4H）， 1.30～1.67（m， 8H）。13C NMR（100 MHz， DMSO）： δ 183.1， 181.0， 157.4， 142.3， 134.2， 124.6， 124.0， 121.0， 118.8， 62.6， 60.5， 49.4， 32.3， 29.8， 25.7， 24.9。ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C32H38N6O6Na 625.2745， found 625.2745）。

2.3 探针溶液的制备和检测方法

配制浓度为1.0 × 102 mol/L的K1、K2探针DMSO储备溶液、浓度为1.0 × 103 mol/L的不同阳离子储备溶液以及pH=7.4 的HEPES（10 mmol/L）缓冲溶液。测试前用HEPES缓冲溶液将上述储备液稀释到所需浓度，在5 mL比色管中分别加入600 μL DMSO、 25 μL K1标准液和适量金属离子标准液， 用HEPES缓冲溶液定容至5 mL， 摇匀， 静置30 min后，测量紫外-可见吸收光谱和和荧光光谱（λex=340 nmf， 激发狭缝10.0 nm， 发射狭缝20.0 nm， 仪器灵敏度为高）。

2.4 细胞成像实验

将复苏的人肝癌细胞HepG2（Human hepatoma cell line，中国医学科学院）用含10%胎牛血清的DMEM培养基， 在5% CO2、37℃条件下培养， 待其贴壁80%左右， 消化、离心、计数，接种到激光共聚焦皿中（50000个/皿）， 在5% CO2、37℃培养箱内培养12 h， 待其贴壁后进行实验。用培养基稀释K1溶液至50 μmol/L，与贴壁后的细胞共培养30 min， 接着用PBS缓冲液洗涤细胞3次，进行共聚焦成像。另外，将细胞与50 μmol/L Ag+溶液培养30 min，然后用探针染色30 min ， PBS缓冲液洗涤3次后，成像分析。

3 结果与讨论

3.1 探针K1和K2对金属离子的识别

采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱考察了探针K1和K2对不同离子的响应。分别测定含有探针K1（50 μmol/L）和金属离子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+（1.0 mmol/L， 20 equiv.）的HEPES-DMSO（7∶1， V/V）溶液的紫外-可見吸收光谱和荧光光谱。加入Ag+后，探针的紫外吸收峰从378 nm蓝移到364 nm处。由荧光光谱可见， 未加入离子前， 探针K1在466和522 nm处的荧光峰强度很低;只有加入Ag+时的荧光强度明显增强， 而其它金属离子的加入对探针K1的荧光强度几乎没有影响，说明探针K1对Ag+具有选择性识别的特性。探针K2对不同离子的响应，只有加入Ag+时，K2荧光强度增强，但增强程度不及K1显著，表明含羟基的长烷基链可降低Ag+的响应。因此， 选择化合物K1作为Ag+荧光探针，进行后续实验。

3.2 共存离子对探针K1识别Ag+的荧光强度的影响

为了进一步确认探针K1对Ag+的选择识别作用， 采用常见的金属阳离子作为干扰物， 研究了探针K1对Ag+的选择性识别能力及抗干扰能力。向探针K1溶液（50 μmol/L）中分别加入浓度为1.0 mmol/L的金属离子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+， 摇匀后静置10 min， 测量466 nm处荧光强度;再分别加入浓度为1.0 mmol/L 的Ag+， 其浓度比为C（K1） ∶ C（Ag+） ∶ C（干扰离子）=1 ∶ 20 ∶ 20， 测量466 nm处荧光强度。结果表明，共存的干扰离子的荧光强度与Ag+单独存在时相差很小，其它共存离子对Ag+的识别也未明显受到干扰离子的影响（其它常见阴离子、有机小分子和生物大分子的干扰实验结果见电子版文后支持信息S12）。上述结果表明，探针K1对Ag+具有良好的选择性和抗干扰性。

3.3 不同浓度的Ag+对K1荧光光谱的影响

通过荧光滴定实验研究探针K1对Ag+的响应情况。随着溶液中Ag+浓度逐步加大， K1在466和520 nm处的荧光强度不断增强， 466 nm处荧光强度变化尤其明显，表明K1可作为开关型荧光探针检测Ag+。Ag+浓度与荧光强度的工作曲线， 在0.05～0.50 mmol/L（1.0～10 equiv.）浓度范围内， 探针 K1 在466 nm处的荧光强度值与Ag+浓度呈良好的线性关系， 线性相关系数为0.9970，检出限为21.2 μmol/L[28]。

配制了一系列探针K1与Ag+总浓度为0.25 mmol/L， 浓度比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的溶液， 测定其在λem=466 nm处的荧光强度，Job 's Plot曲线， 当探针K1与Ag+浓度比为1∶1时， 荧光强度达到最大值，表明探针K1与Ag+的结合比为1∶1。随着Ag+的加入，探针K1在466 nm处的荧光强度不断增强， 依据荧光滴定曲线数值，利用Benesi-Hildebrand方程[23～25]得到其络合常数， 公式如下：

其中，Fmin为探针不加Ag+时的荧光强度， Fmax为加入Ag+后探针最大荧光强度， F为加入不同浓度Ag+时探针的荧光强度， [Ag+]表示Ag+的浓度。依据滴定曲线的数据，以1/[[Ag+]（Fmax-Fmin）]为横坐标， 1/（F-Fmin）为纵坐标得到相应的点， 线性拟合得到线性方程y=7.31 × 104/Ka + 0.003（R2=0.978）， 根据上述方程可计算得结合常数为 Ka=1368 L/mol。

3.4 pH值对探针识别Ag+的影响

考察了体系pH值对探针K1在466 nm处荧光强度的影响。 在pH 5.0～11.0范围内没有变化，探针K1在466 nm处荧光强度变化很小。加入10倍当量Ag+后，在pH 6.0～9.0范围时， 探针荧光强度变化较小。选择在pH=7.4的HEPES缓冲溶液中进行探针的离子选择性、竞争性、浓度滴定实验。探针检测Ag+的荧光响应随时间的变化，探针K1与Ag+的结合在4 min内即可达到平衡， 表明探针K1可快速检测Ag+。

3.5 核磁滴定与DFT分析

探针K1与Ag+的核磁滴定实验结果。研究了探针分子K1中Ha-Hi的化学位移的变化情况， 随着Ag+的加入， Hg的化学位移保持不变， Ha、Hb、Hc整体向高场移动0.006 ppm， Hd向高场移动了0.035 ppm， He、Hf和Hi分别向低场移动0.055、0.010和0.021 ppm。上述结果表明，Ag+可能与两个三氮唑环、蒽醌单元及烷基链的羟基络合[23，29]。

Ag+可与蒽醌上的羰基O、三氮唑上的N、烷基链上的O配位。为了进一步探究探针K1-Ag+的络合模式，利用密度泛函理论（DFT），在B3LYP/6-31G（d）/SDD（Ag）计算水平下，对探针K1结构和K1-Ag+可能的4种络合结构-Ag（a～d）进行了分子构型优化，给出部分结构参数。AgO和AgN键长为2.12～2.53 ， 属于正常成键范围。对络合物中Ag+的结合能进行了计算， 结果表明，Ag+与2个三氮唑环和蒽醌单元络合结构的结合能最大（119.08 kcal/mol）（表1）， 这与核磁滴定实验的结果相同。探针K1和结合能最大的K1-Ag结构。探针与Ag+络合后， 探针分子的三氮唑环发生转位， 蒽醌平面发生轻度弯曲。进一步通过含时密度泛函理论（TDDFT）在ωB97XD/6-31+G（d）/SDD（Ag）水平下对它们的紫外光谱进行模拟， 结果表明，加入Ag+后， 探针K1在370 nm处的紫外吸收峰发生了蓝移，此模拟结果与实验结果相符， 说明本研究采用的泛函和基组在光谱模拟上是可靠的。根据以上数据， 结合文献[23，29]， 推测与Ag+的结合方式。所有计算由 Gaussian09 軟件包[30]运行。

从测得的光谱数据可以推测， 与Ag配位后形成的K1-Ag具有稳定的结构。当激发波长为340 nm时， 探针K1的荧光很弱， 而加入Ag+后， 荧光迅速增强， 原因可能是两条含有羟基的烷基链在激发态自由旋转较强， 加入Ag+后， 蒽醌上的O原子和三氮唑上的N原子同时与Ag螯合， 抑制分子旋转， 使能量损失降低， 因此荧光显著增强，对Ag+具有选择性识别。分子内电荷转移（ICT）是对Ag+有离子选择性的基础，K1的吸收峰蓝移可以归因于ICT， Ag+与蒽醌环上的羰基及三唑环上的氮原子结合， 产生的螯合荧光增强（CHEF）效应也有利于Ag的识别和K1-Ag的稳定[18，19]。

3.6 探针检测HepG2细胞内Ag+测试了探针K1对人体肝癌细胞HepG2的细胞毒性。实验结果表明，培养浓度达到10 μmol/L时， 细胞活性仍超过85%，说明探针K1的细胞毒性较低，可用于活体细胞内的实验。

为评价探针K1在活细胞内检测Ag+的能力，将探针用于HepG2的激共聚焦荧光成像。使用FV 1000激光共焦显微镜观察共焦荧光成像， 在探针K1的细胞成像中， 当细胞内未加入Ag+时， 探针K1 的荧光信号相对较弱;当细胞加入Ag+孵育后，再加入探针K1染色， 探针K1 在两个波段的荧光信号都明显增强， 能够明显观察到加入Ag+后HepG2细胞的荧光成像。

4 结 论

设计合成了两个基于蒽醌的具有不同长度烷基链的新型Ag+荧光探针K1和K2，基于ICT和CHEF络合机理实现对Ag+的识别。探针含羟基的烷基链的长度对识别有影响，烷基链长度太长， 如含有6个碳的K2，其响应能力下降。探针K1与Ag+结合后荧光强度随Ag+浓度增加而逐渐增强。光谱分析表明，探针K1对Ag+具有较好的选择性和灵敏度， 在0.05～0.50 mmol/L浓度范围内，探针荧光强度与Ag+浓度呈较好的线性关系， 且在人肝癌细胞（HepG2）内成功实现了Ag+的成像。通过核磁滴定和DFT计算， 推测其络合机理为： Ag+与蒽醌环上的羰基及三唑环上的氮相结合，使得两个三氮唑环翻转，且蒽醌平面轻度弯曲，导致探针K1的光谱变化及对Ag的识别作用。本研究对检测实际环境生物样品中的Ag+具有潜在的应用价值。

References

1 Beata P， Waldemar W. Food Chem.， 2008， 107： 449-463

2 Barriada J L， Tappin A D， Evans E H ， Achterberg E P. TrAC-Trend. Anal. Chem.，  2007， 26： 809-817

3 Ralston D M， O'Halloran T. V. Proc. Natl. Acad. Sci .USA，  1990， 87： 3846-3850

4 HUANG Chi-Bao， CHEN Hua-Shi， ZENG Bo-Ping， CHEN Xiao-Yuan. Chinese J. Anal. Chem.，  2015， 43（4）： 507-511

黄池宝， 陈华仕， 曾伯平， 陈晓远. 分析化学， 2015， 43（4）： 507-511

5 Chellan P， Sadler P J. Phil. Trans. R. Soc. A，  2015， 373： 20140182

6 Ratte H T. Toxicol. Chem.，  1999， 18： 89-108

7 Wen Y， Xing F， He S， Song S， Wang L， Long Y， Li D， Fan C A. Chem. Commun.，  2010， 46： 2596-2598

8 Drake P L， Hazelwood K J.  Ann. Occup. Hyg. ，  2005， 49： 575-585

9 Qi L， Yan Z， Huo Y， Hai X M， Zhang Z Q.  Biosens. Bioelectron.，  2017， 87： 566-571

10 WANG Shao-Jing， LI Chang-Wei， LI Jin， CHEN Bang， GUO Yuan. Acta Chim. Sinica，  2017， 75： 383-390

王少静， 李长伟， 李 锦， 陈 邦， 郭 媛. 化学学报， 2017， 75： 383-390

11 Xu G， Wang G， He X， Zhu Y， Chen L， Zhang X. Analyst，  2013， 138： 6900-6906

12 Zhou X H， Kong D M， Shen H X. Anal. Chim. Acta，  2010， 678： 124-127

13 SUN Jian-Min， XU Peng， HAN Xue-Tao， SUN Han-Wen. Spectrosc. Spect. Anal.， 2005， 25（2）： 292-292

孫建民， 徐 鹏， 韩雪涛， 孙汉文. 光谱学与光谱分析， 2005， 25（2）： 290-292

14 Tan E， Yin P， Lang X， Wang X， You T， Guo L. Analyst，  2012， 137： 3925-3928

15 Li A F， Wang J H， Wang F， Jiang Y B. Chem. Soc. Rev.， 2010， 39： 3729-3745

16 Ren G， Zhang Q， Li S， Fu S， Chai F， Wang C， Qu F. Sens. Actuator B，  2017， 243： 244-253

17 Zhang X， Li L L， Liu Y K. Mater. Sci. Eng. C，  2016， 59： 916-923

18 Wang Z， Pei X， Li N， Tang X.  J. Mater. Chem. B，  2016， 4： 4330-4336

19 Dang D K， Sundaram C， Ngo Y T， Chung J S， Kim E J， Hur S H. Sens. Actuators B，  2018， 255： 3284-3291

20 Kursunlu A N， Ozmen M， Guler E. Talanta，  2016， 153： 191-196

21 Masters K S， Brse S. Chem. Rev.，  2012， 112： 3717-3776

22 Hou L， Kong X， Wang Y， Chao J， Li C， Dong C， Wang Y， Shuang S.  J. Mater. Chem. B，  2017， 5： 8957-8966

23 Zhang Y J， He X P， Hu M， Li Z， Shi X X， Chen G R. Dyes Pigments，  2011， 88： 391-395

24 Zhang X M， Hao Z M， Zhang W X， Chen X M. Angew. Chem. Int. Edit.  2007， 46： 3456-3459

25 LI Jian-Ling， DING Guo-Hua， NIU Yan-Yan， WU Lu-Yong， DUAN Hong-Ye， FENG Hua-Jie， HE Wen-Ying. Chinese J. Org. Chem.，  2018， 38： 931-939

李建玲， 丁國华， 牛燕燕， 吴禄勇， 段红叶， 冯华杰， 何文英. 有机化学， 2018， 38： 931-939

26 Hemamalini A， Das T M. New J. Chem.，  2013， 37： 2419-2425

27 Aly M R E S， Saad H A， Mohamed M A M. Bioorg. Med. Chem. Lett.，  2015，  25（4）： 2824-2830

28 Han X， Wang D E， Chen S， Zhang L， Guo Y， Wang J. Anal. Methods，  2015， 7： 4231-4236

29 Kim S H， Choi H S， Kim J， Lee S J， Quang D T， Kim J S. Org. Lett.，  2010， 12： 560-563

30 Frisch M J， Trucks G W， Schlegel H B， Scuseria G E， Robb M A， Cheeseman J R， Scalmani G， Barone V， Mennucci B， Petersson G A， Nakatsuji H， Caricato M， Li X， Hratchian H R， Izmaylov A F， Bloino J， Zheng G， Sonnenberg J L， Hada M， Ehara M， Toyota K， Fukuda R， Hasegawa J， Ishida M， Nakajima T， Honda Y， Kitao O， Nakai H， Vreven T， Montgomery Jr J R， Peralta J A， Ogliaro F， Bearpark M， Heyd J  J， Brothers E， Kudin K N， Staroverov V N， Kobayashi R， Normand J， Raghavachari K， Rendell A， Burant J C， Iyengar S S， Tomasi J， Cossi M， Rega N， Millam J M， Klene M， Knox J E， Cross J B， Bakken V， Adamo C， Jaramillo J， Gomperts R， Stratmann R E， Yazyev O， Austin R， Cammi A J， Pomelli C， Ochterski J W， Martin R L， Morokuma K， Zakrzewski V G， Voth G A， Salvador P， Dannenberg J J， Dapprich S， Daniels A D， Farkas O， Foresman J B， Ortiz J V， Cioslowski J， Fox D J. Gaussian 09 Revision D.01， 2013， Gaussian Inc.， Wallingford， CT， 2009