香菇0912液体菌种培养基及摇瓶发酵条件的筛选

李春霞 吴建金 黄亮 孙宁 王玉 班立桐

摘    要：不同菌种对液体培养基中营养物质的利用效率不同，试验以香菇0912作为供试菌株，以菌丝体干质量为指标，通过单因素试验，研究了不同碳氮源、无机盐含量、转速、培养基初始pH、静置时间以及培养基装液量对香菇菌丝干质量的影响，结果表明最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为玉米浆，K2HPO4的最佳用量为0.1%，KH2PO4 的最佳用量为0.1%，初始pH值 5.0，装液量为50 mL，培养温度为25 ℃，静置时间为24 h，转速为180 r·min-1。在此基础上，对液体培养基的组分含量进行了L9（34）正交试验，结果表明4个因素对香菇菌丝干质量的影响表现为：葡萄糖>玉米浆>KH2PO4>K2HPO4，其中葡萄糖和玉米浆的含量对菌丝干质量具有极显著影响（P<0.01），并确定了香菇0912菌株液体深层发酵各组分的优水平为葡萄糖3%，玉米浆0.3%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%，搭配MgSO4 0.05 %，维生素B1 0.005%，在此条件下，菌丝干质量达到2.103 g·L-1，是优化前（1.417 g·L-1）的1.49倍。

关键词：香菇;液体菌种;培养基筛选;摇瓶发酵

中图分类号：S646.1+2          文獻标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.02.001

Abstract： The utilization efficiency of nutrients in liquid medium was different among different strains. In the study， Lentinus edodes 0912 was used as the tested strain. The optimal carbon and nitrogen sources， inorganic salt content， rotational speed and initial pH of culture medium， and also the standing time and medium volume were screened through the single factor experiment， and the dry weight of mycelia was as the evaluation index. The results showed that the best carbon source was glucose， the best nitrogen source was corn pulp， the best amount of K2HPO4 and KH2PO4 was both 0.1%， the initial pH was 5.0， the liquid medium volume was 50 mL， the culture temperature was 25 ℃， the rest time was 24 h and the speed was 180 r·min-1. On the basis， the composition of liquid medium was tested by L9（34） orthogonal test. The results showed that the effects of four factors on the dry weight of L. edodes were glucose > corn pulp > KH2PO4 >K2HPO4， in which the content of glucose and corn pulp had a significant effect on the dry weight of mycelium（P<0.01）， and the optimum conditions for liquid deep fermentation of L. edodes strain 0912 were glucose 3%， corn pulp 0.3%， K2HPO4 0.05%， KH2PO4 0.05%， matched with MgSO4 0.05% and VB1 0.005%， the dry weight of mycelium could reach 2.103 g·L-1， which was 1.49 times of that before optimization （1.417 g·L-1）.

Key words：  L. edodes; liquid strain; culture medium screening; fermentation by shaking flask

香菇（Lentinus edodes）俗称花菇、冬菇，是担子菌纲伞形科真菌，在阔叶性原木上生长较为广泛，被称为“山珍之王”[1-6]。香菇中蛋白质种类繁多，必需氨基酸占有2/3的比例，能够增强体质，促进机体发育[7]。香菇多糖（β-D-葡聚糖），具有免疫调控、健胃、助消化、抑制微生物感染、抗病毒感染、抗肿瘤和抵抗癌症等生物活性[8]。

2016年我国的食用菌产量达3 596.7万t，成为继菜、粮、果、油之后的第五大农作物，而香菇产量为898.3万t，为我国食用菌中产量第一的品种。香菇生产主要为袋栽模式，产地包括古田、庆元、磐安等老产区及西峡、平泉、岫岩等新产区。

香菇0912是抚顺市农科院杂交技术选育而成的优质香菇新品种，具有出菇早、菌丝洁白浓密、抗杂性好、菌棒坚实，高温季节出菇质量好，是辽宁地区香菇的主栽品种[9-10]，经过天津市蔬菜产业技术体系创新团队及相关农技人员的推广，目前在天津市蓟州区栽培面积不断扩大，但主要以农户栽培为主，采用的均为固体菌种。香菇固体菌种有成本高、易受杂菌污染、出菇周期长、工作强度大等缺点[11]。使用液体深层发酵技术制备香菇菌种，并使用该菌种栽培香菇，是香菇高效生产的一种新途径。液体培养具有周期短、流动快、菌丝及其代谢产物较多等优点，而且从其发酵液中提取的有效成分具有保健和药用功能[12]。液体培养基配方的优良对香菇菌丝及其代谢产物的形成至关重要，合适的碳氮源及其比例、无机盐的用量、培养条件对液体培养过程中菌丝的生长有很大影响，在液体发酵过程，营养菌丝在适当的条件下生长更快，新陈代谢更加旺盛。王颖等[13]以抽滤后的菌丝生物量作为指标，对液体培养基进行优化，优化后测得菌丝生物量（干质量）为56.292 g·L-1。

在相同环境下，不同菌种对液体培养基中营养物质的利用效率不同，金卫群等[14]以杏鲍菇的3种不同菌株为研究对象，结果表明不同菌株的出菇量以及生物学转化率具有明显差异。本研究对香菇0912菌株的液体培养基及培养条件进行优化，为该菌株液体菌种在栽培过程中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌种

香菇0912菌株;天津农学院农学与资源环境学院生物技术系食用菌研发中心斜面保藏菌种。

1.2 培养基

母种培养基： PDA培养基;

发酵培养基： 葡萄糖2%、玉米浆0.2%、K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.05%、维生素B1 0.005 %。

1.3 试验方法

1.3.1 菌丝生长曲线的测定 在摇瓶培养过程中的第4～11天取样，过滤、烘干，计算菌丝干质量。以培养时间为横坐标，菌丝干质量为纵坐标绘制菌丝生长曲线图，并根据生长曲线图确定取样时间。

1.3.2 培养基碳源、氮源筛选 （1）在基础培养基条件下，分别以玉米浆、麸皮、蛋白胨、酵母粉作为氮源，含量均为0.2%，5组重复，测定菌丝体的干质量， 确定最佳氮源。

（2）以玉米浆为氮源，分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、土豆粉作為碳源，含量均为2%，5组重复，在第10天取样，测定菌丝体干质量，筛选出最佳碳源。

1.3.3 碳源、氮源、无机盐添加量的筛选 （1）在基础培养基条件下，设置玉米浆添加水平为0.2%，0.3%，0.4%，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳添加量。

（2）在氮源添加量为0.3%的条件下，设置葡萄糖的添加水平为2%，3%，4%，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳添加量。

（3）在氮源添加量为0.3%、碳源添加量为3%的条件下，设置K2HPO4的添加水平为0.05%，0.10%，0.15%，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳添加量。

（4）在氮源添加量为0.3%、碳源添加量为3%、K2HPO4添加量为0.10%的条件下，设置KH2PO4的添加水平为0.05%，0.10%，0.15%，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳添加量。

1.3.4 菌种培养条件筛选    （1）在优选的培养基基础上，转速梯度为120，150，180，210 r·min-1，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳转速。

（2）在优选的培养基基础上，转速为180 r·min-1的条件下，设置不同装液量梯度，装液量依次为50，70，90，110 mL，培养10 d，测定菌丝体的干质量，确定最佳装液量。

（3）在优选的培养基基础上，转速为180 r·min-1，装液量为50 mL的条件下，设定静置时间梯度为12，24，36，48 h，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳静置时间。

（4）在优选的培养基基础上，转速为180 r·min-1，装液量为50 mL，静置时间为24 h的条件下，设置不同pH值梯度，依次为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，培养10 d，测定菌丝体干质量，确定最佳pH值。

1.3.5 正交试验设计 通过单因素试验，确定葡萄糖、玉米浆作为香菇菌丝液体培养的碳源和氮源，K2HPO4、KH2PO4为培养基中主要的无机盐成分，并在筛选K2HPO4、KH2PO4添加量试验的基础上，以葡萄糖、玉米浆、K2HPO4、KH2PO4为研究因素，在初始pH值为5.0，装液量为50 mL，静置时间为24 h，转速为180 r·min-1的条件下培养，设计L9（34）的正交试验，正交试验因素与水平设计见表1。根据菌丝生长曲线确定培养10 d时，并测定菌丝干质量。

1.4 数据处理与分析

采用DPS软件对单因素试验结果进行多重比较分析及正交试验的方差分析。

2 结果与分析

2.1 香菇菌丝生长曲线

香菇菌丝生长情况，菌丝干质量在培养过程中呈现先增加后下降的趋势，在培养的前3 d有萌发现象，在接种的菌块表面有少量绒毛状菌丝，第4～8天，菌丝开始缓慢生长，培养基中出现少量菌丝和较小的菌球，第8～9天，菌丝生长达到快速生长期，培养基中的菌球数量明显增多，菌球变大，至第10天，菌丝体干质量达到最大为1.417 g·L-1，第11天菌丝干质量开始下降，因此，根据香菇0912菌丝生长曲线确定最佳取样时间为第10天。

2.2 不同碳、氮源对菌丝生长的影响

2.2.1 不同氮源 有机氮源的营养物质可作为菌丝生长中合成氨基酸、核酸、蛋白质等代谢过程中的重要物质的来源[15]。含玉米浆的液体培养基中菌丝干质量最大为1.108 g·L-1，表明香菇0912菌丝对玉米浆的利用能力最强，麸皮次之，对蛋白胨和酵母粉的利用能力最差，但各处理间差异均未达显著水平（数据未列出），故筛选出的最佳氮源为玉米浆。

2.2.2 不同碳源 香菇0912菌丝对葡萄糖的利用能力最强，菌丝干质量为1.245 g·L-1，显著高于使用土豆粉、蔗糖、淀粉作为碳源的菌丝干质量，根据菌丝生长情况，适合香菇0912菌丝生长的最佳碳源为葡萄糖，这与覃宝山等[16]对碳源筛选的结果一致。

2.3 营养物质不同添加量对菌丝生长的影响

2.3.1    氮源添加量    在玉米浆添加水平为0.2%，0.3%，0.4%的条件下，菌丝干质量呈现先增加后下降的趋势，且在玉米浆添加量为0.3%时，菌丝干质量达到最大为1.12 g·L-1，显著高于0.2%和0.4%处理。

2.3.2    碳源添加量    在葡萄糖添加水平为2%，3%，4%的条件下，菌丝干质量呈现先增加后下降的趋势，且在葡萄糖添加量为3%时，菌丝干质量达到最大为1.009 g·L-1，显著高于2%和4%处理。

2.3.3 K2HPO4添加量 在K2HPO4添加水平为0.05%，0.10%，0.15%的条件下，菌丝干质量呈现先增加后下降的趋势，且在K2HPO4添加量为0.10%时，菌丝干质量达到最大为0.769 g·L-1，显著高于0.05%和0.15%处理。

2.3.4 KH2PO4添加量    在KH2PO4添加水平为0.05%，0.10%，0.15%的条件下，菌丝干质量呈现先增加后下降的趋势，且在KH2PO4添加量为0.10%时，菌丝干质量达到最大为0.874 g·L-1，显著高于0.05%和0.15%处理，后二者之间表现为0.15%处理显著高于0.05%处理。

2.4 不同转速对菌丝生长的影响

转速越高，摇瓶中的溶氧量越多，越有利于菌丝的生长;但转速过高会产生较大的剪切力，在培养过程中不能够形成菌球，进而影响菌丝生长[17]。随着摇床转速的增加，摇瓶中溶氧量逐渐增加，但菌丝干质量呈现先增加后降低的趋势，在转速為180 r·min-1的条件下，菌丝干质量达到最大为1.187 g·L-1，但处理间差异均未达显著水平（数据未列出），根据试验结果筛选出的最佳转速为180 r·min-1。    2.5 不同装液量对菌丝生长的影响

摇瓶装液量越大，摇瓶中溶氧量反而降低，菌丝干质量也降低，当装液量为50 mL时，摇瓶中溶氧量高，菌丝生长较快，代谢旺盛，菌丝干质量最大为1.221 g·L-1，显著高于其他各处理，故最佳装液量为50 mL。

2.6 不同静置时间对菌丝生长的影响

随着静置时间的增加，菌丝干质量先增加后降低，静置时间为24 h的摇瓶中菌丝干质量最大为1.501 g·L-1，但各处理间差异均未达显著水平（数据未列出），根据试验结果确定静置时间为24 h是适合香菇0912菌株生长的最佳条件，这与覃宝山等[16]的研究结果确定的最佳静置时间为42 h不同，其差异性可能是由于菌种和所采用的液体培养基成分的不同引起的。

2.7 不同pH值对菌丝生长的影响

pH值的高低影响细胞膜的电荷变化，酶活性以及菌丝生物量也会受该因素影响较大[18]。随着pH值的增加，菌丝干质量基本上呈现先增加后降低的趋势，pH值为5.0时菌丝干质量达到最大为1.534 g·L-1，显著高于其他pH处理，pH值为8.0时摇瓶中菌丝基本没有生长，故筛选出的最佳pH值为5.0，这与马琼等[19]对香菇培养条件的优化结果一致。

2.8 正交试验结果分析

由表2可知，在不同的培养基组分下，摇瓶中香菇0912菌丝干质量以A3B3C2D1处理最大，为1.883 g·L-1;根据极差分析结果，影响菌丝干质量的各因素的主次顺序为：葡萄糖>玉米浆>KH2PO4>K2HPO4，方差分析结果（表3）表明，葡萄糖和玉米浆的影响均达极显著水平，而KH2PO4和K2HPO4均未达显著水平;根据正交试验筛选出适合香菇0912菌丝液体培养的培养基组合为A3B3C1D1，这与9个处理中最大值组合A3B3C2D1不一致;经验证，在组合A3B3C1D1的条件下培养，香菇0912菌丝干质量达到2.103 g·L-1，优于A3B3C2D1，即适合香菇0912菌株生长的最佳培养基配方为葡萄糖3%，玉米浆0.3%，K2HPO4 0.05%，KH2PO4 0.05%。

3 结论与讨论

碳源和氮源是菌丝生长过程中最主要的营养物质，菌丝不同的营养物质条件下的生长速率以及在生长过程中产生的代谢产物含量不同，聂建军等[20]研究表明，当培养基中碳源为葡萄糖时，菌丝生物量和胞外多糖产量均明显高于蔗糖，分别提高了5.83和0.85倍。因此，筛选合适的碳氮源在提高香菇菌丝产量上十分重要。魏雅冬等[12]认为香菇对葡萄糖的利用效果较差，菌丝生物量最低，而在本试验中，香菇0912菌株对速效碳源—葡萄糖的利用效果最好，这可能是由于菌株不同，其对葡萄糖的利用效果亦存在差异;土豆粉的营养成分含量较多，同样适于菌丝生长;香菇菌丝对蔗糖的利用速率较慢，其原因有待于进一步研究;淀粉在高温灭菌后需要被水解方可被利用，菌丝对淀粉的利用速率最差。总体来看，试验中所采用的氮源均适合香菇0912菌丝的生长，但对玉米浆和麦麸的利用效率最高，考虑到麦麸会对菌丝干质量的结果造成误差，故选用玉米浆为最佳氮源。pH值筛选结果表明香菇0912菌丝液体培养的最佳pH值为5，与徐思炜等[21]的研究结果一致。

将单因素试验与正交试验相结合，最终筛选出的适合香菇0912的液体培养基以及培养条件为：葡萄糖3%，玉米浆0.3 %，K2HPO4 0.05 %，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05%，维生素B1 0.005%，pH值5.0，装液量50 mL，接种量为直径5 mm的菌块3块，培养温度25  ℃，静置时间24 h，转速180 r·min-1，在此条件下菌丝干质量达到2.103 g·L-1，是优化前（1.417 g·L-1）的1.49倍。

在规模化生产中，液体菌种的培养主要靠发酵罐实现，本试验通过摇瓶培养确定了可参考的香菇0912菌株培养基，而发酵罐和摇瓶的培养控制差异较大，其优化还有待在发酵罐中进一步开展试验研究。

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