富血小板纤维蛋白在骨再生和创面修复中的应用及机制的研究进展

杨波，王少根

作者单位：安徽医科大学第三附属医院、合肥市滨湖医院烧伤整形科，安徽 合肥 230051

作为新一代的血小板浓缩物，富血小板纤维蛋白（PRF）在临床上的应用受到越来越多的关注。与富血小板血浆（PRP）相比，PRF富含大量的生长因子，能够促进破损组织和表皮的修复，并含有多种炎症因子，具有抗感染和免疫调节的作用［1］。另外，PRF的制备不需要添加任何抗凝剂，所有成分均来源于自体，避免了伦理学的争议。其立体的三维结构特点增加了稳定性，适合长期的运用。本文就目前PRF的发展历史、制备方法、结构特点、基础研究、存在的问题以及骨再生和创面修复中的临床应用和可能的机制作一综述，旨在为PRF在组织修复、创面愈合等领域的应用提供一定的理论支持。

1 PRF的发展历史

PRP是1984年从人血液中提取出来。PRP释放生长因子的时间短，不能长期作用于组织修复，存在伦理学争议，且在体外应用时易破碎，效果不稳定，限制了其在临床上的进一步应用［2］。

PRF，2000年由法国人首次提出，是继PRP之后的第二代血小板浓缩品。PRF的制备过程不需要添加抗凝剂等，所有成分均来源于自体，避免了免疫排斥反应和交叉感染的可能。PRF具备由纤维蛋白构成的三维立体网状结构，利于细胞的迁移和增殖，能够缓慢且持久的释放生长因子，进而达到促进创伤愈合的作用［3］。

2006年研究人员提出PRF的变种，即浓缩生长因子（CGF）。与传统的PRF相比，CGF富含更多的纤维蛋白，而且更加黏稠，形成的凝块更大，因此具备具有更高的抗张强度、更多的生长因子以及更高的黏合强度［4］。

2 制备方法及结构特点

2.1 制备方法PRF的制备过程主要分为离心和凝集两个部分，首先取病人静脉血于干燥的未添加抗凝剂的离心管中，立即将离心管置于离心机中，在离心力的作用下，血液中的红细胞沉降加快，不同沉降速率的物质分开，进而实现血液的分层，其中最上层呈淡黄色的为贫血小板血浆层，最下层呈红色的为红细胞碎片层，而两者之间即为富含血小板的纤维蛋白凝胶层。鉴于血小板和白细胞主要聚集在红细胞层和凝胶的交界处，因此在制备PRF时需留取少许的红细胞层，以防止血小板和白细胞的丢失。最后，使用2层无菌纱布对PRF凝胶进行挤压，使其成为稳定的膜状结构供临床使用［5］。

2.2 PRF的结构特点在显微镜观察下，PRF呈现为三维的立体网络结构，主要由纤维蛋白构成，中间的纤维蛋白网较为疏松，周围的较为致密［6］。这种网络结构具备的特点包括：松散的组织、良好的纤维弹性和大孔隙的网状结构，使得组织修复和创面愈合必备的因子和物质能够更好的扩散，进而加速组织愈合的过程。另外，电镜扫描观察发现PRF基质中含有黏多糖，黏多糖对小分子肽有很强的亲和力，可以支持细胞迁移和促进愈合。

血小板以血小板集合物的形式顺着纤维蛋白束聚集。进一步的研究发现在PRF中，血小板和生长因子主要通过化学键的形式与纤维蛋白结合，由于化学键的断裂是一个缓慢的过程，因此PRF中的生长因子可以发挥长效的作用［7］。

3 PRF在骨再生和创面修复中的基础研究

3.1 PRF在骨再生中的基础研究细胞实验表明，PRF呈剂量依赖性的刺激骨间质干细胞的增殖和分化［8］。进一步的研究发现PRF促进成骨细胞的增殖的机制可能与提高成骨细胞的蛋白激酶和骨保护素的表达有关［9］。近期的研究显示PRF不仅可以促进成骨细胞的增殖与分化，还对前真皮角化细胞和前脂肪细胞的增殖具有一定的促进作用。电镜扫描的结果发现将PRF膜与在成骨细胞培养基共培养后，PRF膜边缘开始出现矿化现象，且黏附有白细胞，提示PRF诱导成骨细胞的增殖和分化的作用可能与白细胞有关［10］。另外，PRF还被发现可以促进牙髓细胞的增殖和分化［11］。

动物实验研究显示PRF可诱导牙周膜前体细胞向成骨细胞分化，其机制可能与上调ERK1/2信号通路有关［12］。并且将牙周膜前体细胞与RPF结合形成复合物，可用于大鼠颅骨的缺损修复［12］。研究人员将PRF与种植材料联合应用，进一步验证了PRF具有促进骨愈合的作用。自体骨联合PRF的实验组在犬行双侧上颌窦底提升术中的效果显著优于单独用自体骨的对照组［13］。在PRF联合蚕丝蛋白修复即刻种植骨缺损的实验中，与空白对照组相比，实验组的种植体抗拉伸力显著提高。另外，研究人员将PRF与羟基磷灰石生物陶瓷植入兔拔牙窝内，与单独的磷灰石生物陶瓷组相比，PRF组拔牙窝内的组织愈合快，新生骨组织数量较多且质量较好［14］。Lee的研究将PRF联合蚕丝蛋白修复颅骨缺损的修复中，结果发现实验组骨缺损愈合速度显著快于空白对照组［15］。长骨的骨折治疗周期长一直是临床比较棘手的问题，通常使用愈合促进剂来加速愈合的过程。研究人员评估了PRF作为长骨骨折愈合促进剂的可能，经过4周的PRF治疗，开放性股骨骨折得到了较好的修复，且X线检测结果显示PRF增加了骨组织形成量［16］。另外有研究报道PRF对胫骨骨缺损同样存在积极的愈合作用［17］，以上研究共同提示PRF可能成为长骨骨折愈合过程中的有效生物材料。

3.2 PRF在创面修复中的基础研究徐海燕等［18］的研究将冻干的PRF颗粒应用于小鼠背部全层皮肤缺损的修复中，结果显示，与空白缺损组和上市产品AD甲壳素相比，冻干PRF颗粒组创面肉芽组织形成时间早，创面收缩率明显，形态学观察显示冻干PRF颗粒组创面纤维组织增生活跃，毛细血管和成纤维细胞数量显著多于对照组，提示PRF不仅可以促进创面愈合，还能够提高愈合的质量。同样的研究结果在PRF治疗兔耳皮肤创面的试验中得到进一步证实［19］。

PRF还被应用于糖尿病所致的溃疡创面修复中。汪新伟等［20］的研究以糖尿病兔溃疡创面为模型，观察创面局部使用PRF的疗效，结果发现相比于模型组，PRF组创面预后良好，大量肉芽组织形成，表皮层结果修复，大量新生血管形成，成纤维细胞形成聚集，其中的机制可能与PRF促进血管内皮生长因子（VEGF）的表达有关。Chiaravalloti等［21］以糖尿病裸鼠作为研究对象，与常规敷料组相比，经过14 d的PRF处理，小鼠背部皮肤伤口愈合加快，形态学观察提示其中的机制可能与增加血管形成有关。

近期的一项研究显示PRF对于肠道创面同样存在修复作用。研究人员通过肠系膜缺血/再灌注损伤构建了大鼠肠道损伤模型，在使用PRF后，显著降低了肠道局部并发症，组织学结果显示所有使用了PRF的大鼠肠道近乎完全愈合［22］。

4 PRF在骨再生和创面修复中的临床应用

4.1 PRF在骨再生中的作用PRF具有一定的成骨能力，其机制可能与其长期且缓慢释放生长因子和基质蛋白，并促进间充质细胞转换为成骨细胞有关。因此，可将PRF作为牙周骨缺损治疗的填充剂。与动物实验一致的是，临床研究也显示单独使用或者与人工材料合用时对牙周骨具有良好的治疗效果。有报道表明PRF单独使用时可改善牙齿深度、附着水平和骨密度等方面用于牙周骨缺损的治疗［23］。将PRF分别与合成材料OSSIFITM和羟基磷灰石颗粒形成混合物，观察对牙周骨缺损的效果，组织学观察结果均观察到了良好的骨结构［24-25］。因此，PRF与自体骨的联合使用不仅增加了成骨的比率同时也提高了新骨头形成的质量［26］。

大量的研究探讨了PRF在上颌窦底提升术中的应用。Choukroun等［27］在上颌窦侧壁开窗式窦底提升术中，联合PRF与冻干骨异体移植物作为充填材料减少了在种植体植入前的愈合时间。Mazor等［28］进行上颌窦底提升术时将PRF作为移植材料与种植体同时植入，治疗6个月后，放射学结果显示在上颌窦底的下方一直到种植体的尖端部分有大量的骨质形成，组织学观察显示了良好的骨结构和骨活力。Meyer等［29］首次将β-磷酸三钙联合自体生长因子（内含PRF）应用到上颌窦提升手术中，结果发现，单用β-磷酸三钙联合自体生长因子而不使用骨移植材料，可以显著减少并发症的发生。以上研究提示PRF可能成为一种具有在上颌窦黏膜和骨质上愈合性质的生物材料。

颅底手术导致的骨缺损重建一直是临床面临的一个问题，近期的一项研究评估了PRF对颅底手术部位缺损处的骨再生作用［30］。CT扫描的结果显示骨缺损部位被产生的新骨所闭合，表明PRF具有诱发颅底手术部位缺损处的骨愈合与再生的可能。

4.2 PRF在创面修复中的应用鉴于PRF可以持续且稳定的释放生长因子，其已在创面修复中得到了广泛的应用。近期的一项研究比较了PRP与PRF在面部脂肪移植手术中作用，通过比较手术后的摄影视图，疼痛，水肿和瘀伤情况来评手术的效果，结果发现PRF更适合于面部脂肪移植手术［31］。另外，一系列的研究将PRF应用于面部多个部位的整形手术中，并且取得了良好的效果［32-33］，其发挥作用可能与以下几个方面有关：①PRF包含的血小板具有止血的作用，可减少术后的淤血；②PRF能够调节炎症免疫反应，可减少术后的水肿和疤痕形成；③PRF能够促进胶原蛋白的合成，可减少术后的疤痕形成；④PRF能够促进血管生成，可减少术后皱纹的形成。

目前，PRF在烧伤导致的创面修复中也有研究报道。黎君君等［34］的研究显示PRF可用于治疗儿童面部Ⅱ度烧伤。由于儿童在诊治过程中配合度低，家属对创面愈合要求高，因此，提高创面愈合的速度和质量成为烧伤科亟待解决的问题。PRF的网状纤维蛋白结构与天然的组织结果类似，有利于细胞的移动过程，进而增加了烧伤创面的愈合过程。与单用等渗盐水纱布覆盖半暴露的对照组相比，PRF联合壳聚糖创面修复膜凝胶治疗不仅提高了创面的愈合率，同时也缩短了愈合的时间，减少了疤痕指数，值得在烧伤科推广使用。

另外，近期的研究显示PRF对各种疾病所致的溃疡面均具有一定的修复作用。由汉森病导致的不愈合性营养性溃疡是导致病人残疾的主要原因之一，研究人员探讨了PRF在此种疾病中的治疗作用，结果发现7名受试者的93.52%的溃疡面得到了较好的改善，且无不良反应的报告产生，因此，PRF治疗汉森病病人的营养性溃疡被认为是一种可行、安全、简单且廉价的方法［35］。另一项随机对照研究探究了PRF对治疗静脉性腿溃疡面的治疗作用，结果发现经过4周的PRF治疗病人的溃疡面减少了85.51%，接近是生理盐水对照组的两倍［36］。Londahl等［37］的研究将leucopatch（一种PRF的类似物）运用于糖尿病足所致的溃疡创面的修复中，结果发现73%的病人在20周内溃疡面到达愈合。国内学者探讨了PRF在骨折术后深部组织及内置物外露创面中覆盖创面的临床疗效，结果发现11例创面均愈合良好，且原骨折部位骨痂形成良好或骨折已愈合，避免了病人二次手术的风险［38］。郑丽君等［39］改进了PRF的制备方法，制备出微泵法富血小板纤维蛋白基质（PRFM），并在感染性溃疡、静脉淤血性溃疡、创伤性溃疡和糖尿病性溃疡创面修复中均取得了良好的效果。

5 PRF的作用机制

PRF主要是由纤维蛋白基质和细胞（血小板、白细胞）等共同构成的。机制研究发现PRF发挥促进创面和骨组织愈合的作用可能通过血小板生长因子、白细胞因子和纤维蛋白基质的共同调节。

5.1 PRF促进骨再生的机制大量的研究显示PRF促进骨再生的机制可能与碱性磷酸酶（AKP）活性［40］、骨保护蛋白（OPG）［41］、骨形态发生蛋白（BMP）［42］和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）［43］的表达密切相关。研究发现将PRF填充于骨缺损的区域，AKP的活性逐渐增高，在第14天达到峰值且矿化的程度也达到最大［43］。另有报道显示将PRF与人成骨样细胞MG-63共培养时，细胞内OPG和RANKL蛋白的表达均显著升高，提示PRF具有抑制破骨细胞活化的作用［44］。另外，BMP被发现在PRF发挥促进骨再生的机制发挥一定的作用。研究发现PRF可缓慢的释放BMP，进一步的研究发现BMP联合TGFβ可促进间质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞，增加骨细胞中AKP的活性，上调骨钙蛋白的表达，提高成骨细胞的活性［45］。

5.2 PRF促进伤口愈合的机制当PRF中含有的血小板被激活时，会释放大量的血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（ECG）、胰岛素样生长因子（IGF-1）、转化生长因子（TGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）等［46］。创面局部的新生血管的形成是创面能否愈合的关键环节。VEGF被认为在促进新生血管和肉芽组织的形成过程中发挥着重要的作用，其机制可能与VEGF调控血管内皮细胞的增殖与分化，增加血管内皮细胞的通透性有关［47］；研究表明，PDGF具有促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的迁移和增殖的作用，进而加快局部血管的重建［48］；动物实验发现皮下注射TGFβ可以增强新生鼠血管的形成，进一步的研究发现，TGF可能通过Smad蛋白直接调控VEGF和PDGF来发挥促血管形成的作用［49］。

PRF中含有的白细胞及其分泌的免疫因子可增加创面局部抗感染的能力，加快受损组织的愈合速度。近期的研究证实当PRF中的白细胞被局部炎症因子激活时，可有效的抑制局部炎症反应，对抗创面的感染［50］。另外，由单核巨噬细胞分泌的白介素-1β（IL-1β）被认为在炎症反应初期可以聚集白细胞，达到改善局部炎症的过程［51］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在炎症反应和抗感染等方面发挥着重要的作用，与相应的受体结合后，可调控NF-κB信号通路，诱导IL-6的产生，进而介导炎症反应［52］。

此外，由于PRF具备的独特的立体三维结构，PRF可以缓慢且持续的分泌各类生长因子和细胞因子，在整个创面修复的过程中均可发挥调控作用。

6 PRF的应用优势及存在的问题

6.1 PRF的应用优势特点与PRP相比，PRF的应用优势可概况为5个方面：（1）首先，与PRP相比，PRF最显著的优势在使用安全性上，由于PRP在制备过程中需要添加异种来源的凝血酶和抗凝血制品，可能导致免疫排斥反应的发生和感染性疾病的传播，而PRF所有成分均来自自体，不需要加抗凝剂，无伦理道德争议及血液交叉感染风险；（2）与PRP相比，PRF能够缓慢且持久的释放生长因子，更加有效地促进脂肪间充质干细胞（ADSCs）的分化与增值，明显改善对破损组织的修复效果；（3）PRP中添加了高浓度的牛凝血酶形成了致密的PRP膜，不利于细胞因子的滞留和细胞的迁移，而PRF中未添加外源性的凝血酶，自身含有的凝血酶浓度较低，进而形成了柔韧多孔的PRF膜，有利于细胞因子的滞留和骨髓干细胞的迁移；（4）PRP为四分子结构，而PRF经过自然聚合过程，形成的纤维蛋白主要为三分子立体网状结构，使得PRF更加坚实稳定；（5）PRP的制备过程尚未标准化，最有效的浓度和局部环境有待进一步研究，且制备过程需加入异种凝血酶和抗凝血制品，使得制备过程繁琐，需要占用较多的时间，而PRF的制备过程较为简单且操作容易；（6）目前PRP在临床上很少单独使用，需要其他材料联合应用，且主要发挥的是辅助作用，而PRF是具有弹性质韧的半透明膜结构，可作为自体源性生物材料应用于临床，如植骨手术中。

6.2 PRF临床应用存在的问题目前限制PRF在临床广泛应用的主要问题是PRF的保存时间短，制取后需立即使用。因此，延长PRF的保存时间成为近期研究人员关注的热点之一。有研究显示通过真空低温冷冻干燥法获取的冻干PRF能够保留PRF的活性，使得PRF能够长期冷藏，使用简便和灵活［53］，但经过超低温冷冻保存前后的PRF的生物学作用是否存在差异还需进一步大量的临床实践予以确认。

另外，由于PRF的制备过程中未加入抗凝剂，因此采血及离心的速度必须快，否则会导致制备的失败，不能形成大块的纤维蛋白网。

PRF的临床研究报道多为病例报告和小样本的对照研究，缺乏多中心的、大样本量的随机对照研究，无统一的实验标准，使得目前的临床研究结果缺乏说服性和可比性。

7 展望

作为第二代自体血小板浓缩物，PRF具备明显的优点有：包括避免了过敏反应、免疫排斥、交叉感染以及伦理道德等问题、制备过程极为简单，无需添加任何抗凝剂和凝胶剂，成本低廉。目前PRF的制备方法已经十分成熟，法国尼斯公司已开发出一套专门用于制备PRF的器械，为标准化制备PRF提供了方便。由于PRF的结构特点和组成成分，PRF可作为自体生物填充材料，广泛的应用于与组织修复、创面愈合等相关临床医学领域。