茶园土壤中优势菌株毛霉菌的分离、纯化及鉴定

周小露，刘丽明，宋加艳，宋丽莎，田茂燕，王利荣，周才碧

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410000；2.黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州都匀 558000；3.黔南州广播电视大学物理系，贵州都匀 558000）

贵州是我国唯一兼具低纬度、高海拔、寡日照、多云雾、无污染、全境高原的茶区，截至2017年底，全省茶园面积为47.84万hm2，其中，黔南州的种植面积为10.73万hm2，占贵州省茶园总面积的21%，是重要茶区之一。黔南州《关于进一步加快推进茶产业发展的意见》中提出了有机茶的发展方向，其关键是增加茶树专用有机肥的使用。

目前，使用化肥已造成贵州部分地区茶园土壤酸化以及茶树植株矮小、产量降低等问题[1-2]。农作物秸秆内含有大量的有机物，不仅可以增加土壤的有机含量、补充大量元素，而且是最常见的能作为生物有机肥的原料之一。生物有机肥制作使用的是天然原料，比如秸秆、微生物、腐殖质等，通过有效菌种发酵产生的多种可溶性生理活性物质，如有机酸、维生素等，能被植物迅速吸收，从而达到改善土壤质量的目的。施用有机肥[3-7]可降低土壤的酸化程度，有利于加快土壤中氮、磷等元素循环[8-11]，有助于缓解土壤酸化趋势[12-14]，减少Cd等[15]重金属的累积；促进茶树提早萌发[16]，茶叶长势良好，芽叶密度大，百芽质量明显增加，还可增加茶鲜叶中的茶多酚、咖啡碱、水浸出物、可溶性糖的含量，明显降低茶叶氟含量。

土壤是植物吸收养分的主要来源之一，通过施肥能改良茶树因缺少大量元素带来的叶片发黄等问题。茶树专用有机肥既可作基肥又可作追肥，速效与缓效养分协调、肥料利用率高，可减轻土壤中硝酸盐积累以及磷钾肥造成的重金属污染。因此，茶园专用有机肥的研制具有非常重要的意义。

本试验以黔南州茶园优质土壤为材料，分离、纯化得到优势菌株，利用形态学和分子生物学方法鉴定，旨在明确优势菌株的种属关系，为茶园专用有机肥的开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为土样，采集于贵州省黔南州都匀市三江堰茶园。

1.2 试剂与仪器

蔗糖、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁、磷酸二氢钾（寿光市艾益农生物科技有限公司），硝酸钠（北京化工厂），氯化钾（天津市福晨化学试剂厂），均为分析纯；琼脂粉（寿光市艾益农生物科技有限公司）。

试验仪器为电子显微镜（XSP-8C，德卡精密量仪有限公司）；电子天平（LTI000B，常熟市天量仪器有限责任公司）；恒温培养箱（BIC-250，德卡精密量仪有限公司）；超净工作台（SW-CJ1FDA，德卡精密量仪有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（GI54DS，致微仪器有限公司）；冰箱（BCD-251WBSV，常熟市天量仪器有限责任公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基配制 参考周才碧等[17]的方法，按试验要求进行适当修改。PDA培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂粉20 g。WA培养基：琼脂粉13 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3.2 菌株分离培养 称取20 g茶园土样放入三角瓶，加入80 mL无菌水，摇匀制备成菌种悬液，并将其稀释成不同浓度菌种溶液，备用。再用接种环蘸取不同稀释浓度的菌种悬浮液1～2滴，采用涂布法接种于PDA培养基上，每个稀释浓度做6个重复；将PDA培养基放入28℃恒温培养箱中，培养6～7 d，有菌落形成时，即对菌株进行纯化处理。

1.3.3 菌株纯化培养 待培养基上的菌落培养6 d、可以明显观察到菌落时，挑选生长旺盛菌落，用平板划线法接种到PDA培养基上；并将培养基放入培养箱继续培养，待菌落长出较多时，继续划线纯化，直到纯化出单一菌落。

1.3.4 菌株形态特征观察 利用电子显微镜对菌种菌落的孢子囊、分生孢子、厚垣孢子及生长速率等形态特征进行观察记录，以对该菌种菌落的类型进行初步判断。

1.3.5 菌株生长速率测定 在无菌环境下，把优势菌株打成直径为5 mm的菌饼，再转移至25℃培养箱中，培养7 d，量取菌落直径并再次记录其特征。

1.3.6 菌株分子生物学鉴定

1.3.6.1 DNA的提取 挑取约1 mg优势种菌丝，研磨，依次加入 500 μL 裂解液，150 μL KAC，50 μL异丙醇，反复离心15 min；收取上清液，加等体积70%的乙醇，离心10 min；等待水分散失，加0.1×TE 30 μL，收集上清液得优势种菌丝DNA。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，紫外分光光度法检测DNA的浓度，再稀释至30～50 ng/μL，备用。

1.3.6.2 PCR扩增 用于引物筛选的PCR扩增反应的总体积为 25 μL：1 μL DNA 模板，10×buffer的缓冲液体 2.5 μL，dNTPs2 μL，正反向引物各 1 μL，ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL，ddH2O17.4 μL。PCR 扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环32次；最后72℃延伸5min；12℃保存备用。以通用引物ITS4（5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′，苏州金唯智生物技术有限公司合成）进行PCR扩增，4℃冰箱保存PCR扩增产物。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离检测，将PCR扩增产物送到测序公司进行测序。

1.4 数据统计

所得序列提交到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸数据库，通过 BLAST 程序，将28SrDNA序列与GeneBank中的核酸序列进行对照，并从数据库中获得相关序列。采用MEGA 6.0软件进行多序列比对，并利用Neighbor-Joining方法构建进化树，确定菌株类别。

2 结果与分析

2.1 目标菌株的分离、纯化

以茶园优质土壤为材料，利用稀释涂布分离得到5种菌；进一步利用平板划线纯化该菌株，最终得到优势菌株S1（图1），该菌株在25℃，PDA培养基中生长旺盛，生长周期较长。

2.2 目标菌株的鉴定

2.2.1 形态鉴定 利用传统形态学鉴定的方法，对2.1分离、纯化得到的菌株S1进行观察。利用电子显微镜观察，优势菌S1特征鲜明，易识别，菌落大、质地疏松、不透明、白色绒毛、菌丝无隔、多核、分枝状，孢子呈椭圆形，在培养基内广泛蔓延。根据菌株S1的菌落和孢子形态等特征，初步推断该菌属为毛霉菌（图 2）。

2.2.2 分子鉴定 提取菌株S1的DNA，进行凝胶电泳及PCR扩增，得到1条515bp的清晰条带（图3）；将此PCR产物测序后提交到 GenBank中，经BLAST比对后发现，优势菌S1的rDNA-ITS序列与Rhizomucor（KX343955.1）的序列相似度高达 99%。依据比对结果构建系统进化树（图4），结果表明，该菌应归为Rhizomucor，结合形态学与分子生物学鉴定，确定从茶园土壤中分离纯化出的菌为毛霉菌。

毛霉菌（Mucor）的具体分类地位如下：

——真菌界Mycota

——接合菌亚门Zygomycoina

——接合菌纲Zygomycetes

——毛霉目Mucorales

——毛霉属Rhizomucor

——毛霉菌Mucor

3 结论与讨论

以黔南州茶园优质土壤为材料，进行稀释，并将样品悬液涂布于培养皿培养得到多种菌种，又对菌种进行分离，再挑取菌种纯化得到优势菌株。

为了明确优势菌株的种属关系[18]，本研究对于优势菌株的鉴定首先采用传统的生物形态学鉴定法，利用电子显微镜进行观察，初步确定该优势菌株为毛霉属；其次，对于优势菌株采用ITS序列（分子）鉴定法，确定其为毛霉菌。

毛霉菌可有效地转化腺嘌呤[19]、产生脂肪酶[20]和不对称还原4-甲基苯乙酮[21]，在工农业上有着极高的利用价值，且分解能力较强，是有机肥目标菌株之一。