儿童肺结核支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测的诊断准确性研究

祁 雪 彭小姗 郭 琰 刘 芳 刘 洋 廖 琼 朱 渝 吴喜蓉 尹青琴 马渝燕 饶小春 焦安夏 孙 琳

传统的结核分枝杆菌(MTB)培养耗时较长，不能满足临床上早期、快速诊断的需求[1，2]。抗酸染色涂片方法无法区分MTB和非MTB。同时，儿童结核由于载菌量少、标本难以采集等特点，临床很难获得病原学诊断的证据。因此建立新的、准确性更高的诊断方法，可有效提高儿童结核病尤其是临床诊断儿童结核病的诊断效率。

Xpert MTB/RIF检测是一种全自动实时半巢式核酸扩增技术，主要用于结核病的快速检测并可同时检测利福平耐药[3]。其优势在于，①可实现被检测靶标在短时间内数百万倍的扩增，有效弥补了结核病患儿标本细菌载量低的问题，提高了诊断敏感度；同时，在疾病早期体内细菌量较少的情况下检测，有助于实现疾病的早期诊断；②可在2 h内完成检测；③可同时检测利福平耐药相关基因。该方法已被广泛应用于成人结核病诊断，但在儿童结核诊断中应用相对较少。而且，儿童结核通常病原学阴性，因此该方法在儿童结核病病原学诊断中的价值更高。本文采集支气管肺泡灌洗液，评估Xpert MTB/RIF检测在儿童肺结核中的诊断价值，以期为儿童结核病诊断提供病原学依据。

1 方法

1.1 研究设计 诊断准确性研究。以支气管肺泡灌洗液作为病原学检测标本，以病原学诊断为金标准，以临床诊断活动性结核病为相对金标准，以Xpert MTB/RIF为待测标准，考察支气管肺泡灌洗液的Xpert MTB/RIF对儿童结核病的诊断价值。

1.2 伦理 本研究分别通过首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会的批准，伦理号：2018-96。

1.3 病例纳入和排除标准 2010年9月10日至2018年9月19日就诊于首都医科大学附属北京儿童医院和四川大学华西第二医院，疑似活动性结核病的临床症状和体征，行纤维支气管镜检查并留取了支气管肺泡灌洗液的患儿。排除支气管肺泡灌洗液标本量不足以同时完成本研究多种方式的病原学检测，或虽行支气管肺泡灌洗液标本采集但住院时间少于2 d的患儿。

1.4 病原学诊断结核标准 有疑似活动性结核病的临床症状和体征，涂片抗酸杆菌检测阳性和/或分枝杆菌培养阳性且经菌种鉴定为MTB复合群[4]。

1.5 临床诊断结核标准 有疑似活动性结核病的临床症状和体征，同时伴胸部影像学改变及免疫学检查(结核菌素皮肤试验或γ干扰素释放试验)阳性，抗结核治疗有效，经鉴别诊断排除其他肺部疾病[4]。

1.6 气管、支气管结核诊断标准 符合本文病原学诊断和临床诊断结核标准，存在支气管镜下典型的气管、支气管内膜结核病变和典型的组织病理学改变；胸部影像学检查符合气管、支气管结核影像学改变[4]。

1.7 非结核呼吸道感染性疾病诊断标准 同时满足以下条件:①存在确切的其他病原感染证据(如其他细菌、病毒、支原体感染等)；②常规抗炎治疗后病情好转或治愈；③存在呼吸系统感染症状，且除外结核病诊断；④诊断为其他呼吸系统感染性疾病。

1.8 Xpert MTB/RIF检测 根据产品说明书操作。取支气管肺泡灌洗液0.8～1 mL于无菌离心管中，1∶1加入配套样本处理液，<2 mL者加处理液补足2 mL，充分震荡10～15 s。使用试剂盒内提供的专用无菌移液管，取2 mL处理后样本由检测匣的加样孔缓慢加入，关闭检测匣的盖子，置于检测模块，仪器开始自动检测。Xpert MTB/RIF检测到MTB目标DNA后，基于样本中MTB的Ct值，间接反映所检测样本中MTB的载量，以高、中、低、极低来显示。

1.9 药物敏感性检测 通过对利福平耐药位点的检测，对MTB菌株进行药物敏感性检测，结果分为利福平耐药、不耐药和不确定结果。PCR扩增该菌株的一线抗结核药物耐药相关基因，并通过一代测序检测其耐药基因突变情况，包括异烟肼耐药相关的靶基因katG、mabA-inhA启动子区和利福平耐药相关的rpoB-RRDR基因。

1.10 统计学分析 计数资料采用率或构成比进行描述。分别以病原学诊断和临床诊断为金标准，根据四格表计算Xpert MTB/RIF检测方法的诊断性参数指标，组间比较采用卡方检验(其中两组间细菌载量等级的比较采用行乘列卡方)。P<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 23.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 一般资料 符合本文纳入和排除标准的疑似结核病患儿351例，男198例，女153例，年龄18 d至16岁，平均(5.9±3. 9)岁。诊断肺结核125例，其中病原学诊断结核43例(34.4%)，23例(53.5%)为涂片抗酸杆菌检测阳性，28例(65.1%)为分枝杆菌培养阳性；临床诊断结核82例(65.6%)。肺结核合并支气管结核51例(40.8%)。非结核呼吸道感染性疾病226例，其中肺炎支原体肺炎187例(82.7%)，细菌性肺炎39例(17.3%)。

2.2 Xpert MTB/RIF在儿童肺结核的诊断参数 表1显示，病原学诊断+临床诊断结核敏感度61%(95%CI：52%～69%), 特异度100%(95% CI：98%～100%),阴性预测值82%(95%CI:77%～86%)；敏感度病原学诊断结核高于临床诊断结核(79.1%vs51.2%),差异有统计学意义(χ2=9.18，P=0.002),特异度均为100%，阴性预测值均>85%; 肺结核合并支气管结核敏感度高于单纯肺结核 (80.4%vs47.3%)，差异有统计学意义(χ2=13.88，P<0.001),特异度均为100%，阴性预测值均>85%。

表1 Xpert MTB/RIF检测在儿童肺结核诊断中的准确性参数[% (95% CI)]

病原学诊断结核中，Xpert MTB/RIF检测阳性34例，其中极低MTB载量14例(41.2%)、低载量11例(32.4%)、中等载量7例(20.6%)、高载量2例(5.9%)。临床诊断结核中，Xpert MTB/RIF检测阳性42例，其中极低MTB载量20例(47.6%)、低载量20例(47.6%)、中等载量2例(4.8%)。根据Xpert MTB/RIF检测的半定量结果等级进行比较，支气管肺泡灌洗液的MTB核酸检出载量病原学诊断结核高于临床诊断结核，差异有统计学意义(χ2=7.37，P=0.025)。

2.3 Xpert MTB/RIF在儿童肺结核耐药中的检测 76例Xpert MTB/RIF检测阳性儿童中，利福平耐药2例(2.6%)。1例为全身播散性结核病患儿，予异烟肼、利福平、吡嗪酰胺三联抗结核治疗；支气管灌洗液Xpert MTB/RIF检测MTB载量极低，胃液和支气管灌洗液标本均培养出MTB，同时行异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素的药物敏感性试验，该菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇均耐药。1例诊断肺结核合并支气管结核，予异烟肼、利福平二联抗结核治疗；支气管灌洗液Xpert MTB/RIF检测MTB载量中等，胃液、痰液和支气管灌洗液标本均培养出MTB，同时行异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素的药物敏感性试验，该菌株对上述药物均敏感；均未发生耐药突变。

3 讨论

儿童结核病因载菌量少等原因往往难以获得病原学阳性结果，常为临床诊断结核。有研究数据显示，病原学诊断的儿童结核<40%，在疑似结核病儿童中涂片阳性率更低(<20%)[5]。我国最新出版的《肺结核诊断》行业标准中，分子生物学方法也被作为病原学诊断的依据之一[4]。因此，寻找新的分子生物学方法，评价其在我国儿童结核病诊断中的应用价值，对于提高临床诊断结核病检测的敏感度十分重要。

Xpert MTB/RIF方法是一种基于全自动实时半巢式核酸扩增为主的技术，主要用于结核病的快速检测并可同时检测利福平耐药。2014年WHO颁布的《儿童结核病管理指南》[6]推荐将其用于儿童结核病的诊断，建议在疑似儿童结核病、耐多药结核病以及结核性脑膜炎儿童脑脊液的检测中，其可先于抗酸染色法或细菌培养法作为初筛；而对于疑似肺外结核病的非呼吸道标本，在条件允许的情况下，其可作为传统的抗酸染色、细菌培养或组织病理学的替代方法。WHO同时指出，由于该方法在儿童的研究数据较少，部分建议的证据等级较低。因此，开展Xpert MTB/RIF方法在儿童不同体液和组织标本中的临床价值研究，对于推动儿童结核病的早期诊断具有非常重要的临床意义。

本研究选择的待测标本类型为支气管肺泡灌洗液。研究显示有多种类型的标本均可用于Xpert MTB/RIF的检测，包括咳出痰或诱导痰、胃液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、鼻咽分泌物、组织和粪便等。但该方法在不同样本类型中检测的敏感度存在差异；同时即使同一种类型的样本，各研究的结果也差异较大[7-9]。

较多的研究提示，支气管肺泡灌洗液的敏感度较高。研究中，Xpert MTB/RIF检测在病原学诊断和临床诊断结核患儿中支气管肺泡灌洗液中敏感度分别为88%和33%[10]。

本研究病原学诊断结核患儿中， Xpert MTB/RIF的敏感度为79.1%。尽管分子生物学原则上具有较高的灵敏度，但在本研究中相对于培养和抗酸染色，仍有9例为假阴性。原因主要有，①病原学阳性的结核病患儿均为采集多种类型标本(痰液、胃液、支气管肺泡灌洗液等)且连续多次采样进行病原学检测，任一标本阳性即诊断为病原学诊断结核；而Xpert MTB/RIF检测仅采集支气管肺泡灌洗液且仅进行了一次检测。②Xpert MTB/RIF检出MTB的下限是112.6 CFU·mL-1，其灵敏度仍有待进一步提高。因此Xpert MTB/RIF检测阴性不能除外活动性结核病，要结合临床进行综合判断。在现有试剂盒的基础上，其二代产品Xpert MTB/RIF Ultra已经用于儿童结核病的诊断。同样是以支气管肺泡灌洗液为待测标本，本课题组采用Xpert MTB/RIF Ultra在病原学诊断结核病患儿的敏感度可达到91%[11]。但是相对于传统的培养方法，分子生物学检测的优势更在于其快速的特点。相对于培养4周以上的检测周期，Xpert MTB/RIF可以在2～3 h内得到检测结果，非常有助于临床的早期诊断。

Xpert MTB/RIF在本研究中最为重要的结果是其在临床诊断结核患儿中的价值。在无法得到病原学证据的82例临床诊断结核患儿中，Xpert MTB/RIF仍然能够在42例患儿中检出MTB。本课题组前期研究显示[12]，在初治结核病患儿中支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF在MTB培养阴性的结核病患儿中的阳性率为33.9%；在抗酸染色阴性的结核病患儿中的阳性率为48.7%。Lu等[13]和Le等[14]研究也显示，临床诊断结核患儿支气管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测阳性率分别为48.2%和28.6%，提示支气管肺泡灌洗液的Xpert MTB/RIF检测有助于检出临床诊断结核患儿。如果将Xpert MTB/RIF检测结果作为结核病确诊依据，可将儿童结核病的确诊率大幅提高，有助于解决儿童结核病标本中细菌载量低的问题。

此外，由于传统的药物敏感性实验需要在获得细菌菌株后才能进行，往往需要>1个月的时间获得结果，远滞后于临床需求。而分子生物学方法可以通过耐药基因的检测弥补耐药表型检测的滞后性。本研究中，76例Xpert MTB/RIF检测阳性患儿中，利福平耐药检出2例，提示该方法有助于临床医师快速获得利福平耐药结果，有助耐药结核病的早期诊断。Xpert MTB/RIF检测为利福平耐药的患儿中，其中1例患儿通过传统的药物敏感性试验以及一代测序技术未发现其存在耐药基因的突变。由于儿童结核病耐药率低于成人，培养的阳性率也很低，因此难以获得儿童结核病耐药菌株，导致缺乏儿童耐药相关数据。因此，关于Xpert MTB/RIF检测在儿童耐药结核病诊断中的应用价值仍然需要进一步的验证和研究。