LncROR在促进鼻咽癌细胞增殖及上皮-间质转化作用中的研究*

张雪 薛晓成 陈晓平 张燚 滕伟强 李璨 鲁丹

1上海市浦东新区公利医院中心实验室（200135）

2上海市浦东新区公利医院耳鼻咽喉科

3第二军医大学长海医院耳鼻咽喉头颈外科（上海）

4宁夏医科大学在读研究生

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方地区高发肿瘤之一，占头颈部肿瘤发病率首位，其发病率呈不断上升趋势[1]。上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition,EMT）是上皮细胞失去细胞极性并获得间充质表型，从而诱导细胞增殖迁移的过程[2]。研究表明，上皮-间质转化在鼻咽癌的发生中起重要作用，但具体机制尚不清楚。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，LncRNA具有调控基因间相互作用，并在肿瘤致病过程中扮演重要角色[3]。基因间LncRNA-重编码调控因子 [regulator of reprogramming（ROR），LncROR]是由Loewer首先在胚胎干细胞中发现，其主要参与细胞重编程过程[4]。近期研究表明，LncROR在多种肿瘤组织及细胞中异常表达[5]，但对于LncROR在鼻咽癌中的研究，国内外少见相关文献报道。本研究通过在组织和细胞水平检测LncROR在鼻咽癌中的表达，及对细胞增殖、抗凋亡和上皮-间质转化的影响，旨在为鼻咽癌的发生、发展及研究新的治疗靶点提供理论依据。

资料与方法

1 临床样本收集

收集2016年6月～2017年6月上海市浦东新区公利医院及长海医院经病理确诊的初治鼻咽癌患者及慢性鼻咽炎患者的病例标本各15例，所有鼻咽癌病理诊断均为未分化非角化型癌（WHO分型），临床分期Ⅱ期2例，Ⅲ期8例，Ⅳ期5例（UICC头颈肿瘤临床分期第六版，2002年），肿瘤及鼻咽炎组织标本获取后经液氮冻存。所有患者术前均未行放疗、化疗及其他辅助治疗，最终诊断由常规病理检查确诊。该研究通过公利医院伦理委员会审核批准,并获得患者及家属的知情同意。

2 细胞培养

人鼻咽癌细胞株CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1及人鼻咽部上皮细胞株NP69，均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所细胞库。细胞均按细胞培养说明使用RPMI-1640培养基（Hyclone,SH30809.01）添加10%胎牛血清(biowest,S1820-500)、1%浓度 100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素进行培养。细胞培养于37℃，CO2体积分数为5%的饱和湿度的细胞培养箱中。

3 实时荧光定量聚合酶链反应

使用总RNA提取试剂盒（中国上海飞捷生物公司，220010）提取细胞和组织总RNA。使用Rever Tra Ace qPCR-RT反转录试剂盒（日本Toyobo生物有限公司，QPK-212T）进行反转录反应合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本Toyobo生物有限公司，PCR311）使用说明进行qRT-PCR检测。qRT-PCR及数据采集均使用ABI PRISM 7900HT序列检测系统 (美国Applied Biosystems公司)，GAPDH作为内参。

4 LncROR沉默稳定转染细胞株及对照组细胞株构建

鼻咽癌细胞CNE-2种于6孔板中，置于37℃，5%CO2分压的细胞培养箱中培养，生长24小时后，将合成的siRNA-ROR基因沉默转染序列用siRNA-Mate转染（上海吉玛生物公司，G04001），48小时后换液，进行后续实验。

5 CCK-8法检测CNE-2细胞增殖情况

细胞按30%～50%的浓度比例铺于96孔板，24小时待细胞贴壁后，进行siRNA转染,转染结束后,用PBS清洗3次。每孔加入CCK8试剂（日本同仁化学,CK04），在37℃细胞培养箱中孵育3小时，分别在 0、12、24、48、72 小时时间点用酶标仪检测，吸光度值为450nm波长，绘制细胞增殖曲线，每组实验重复3次。

6 Western blot法检测蛋白

细胞蛋白提取后，BCA法测蛋白浓度（江苏碧云天生物公司，P0010S）。配10%分离胶进行电泳(江苏碧云天生物公司，P0012A)，转膜后孵育一抗（1：1000稀释）4℃过夜，用TBST清洗3次后，二抗（1：2000稀释）室温孵育2小时，用TBST清洗3次后。用凝胶图像处理系统分析目的条带灰度值，完成统计 分 析 。 抗 体 ：Activated caspase-3（9661），Total caspase-3(9662)，Activated caspase-9（9505），Total caspase-9 (9502)，E-cadherin (14472)，β -catenin(8480)，N-cadherin(13116)，Vimentin(5741)，GADPH（5174）均购自于Cell Signaling公司。

7 统计学分析

结果

1 LncROR在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株中表达升高

用实时定量荧光PCR法检测临床样本中LncROR的表达水平。鼻咽癌患者瘤体组织LncROR表达水平明显高于慢性鼻咽炎组织，(P＜0.05,图1)。为了进一步验证LncROR在鼻咽癌中的表达情况,我们选择在1种正常鼻咽部上皮细胞株NP69及4种鼻咽癌细胞株中 (CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1)进行LncROR表达水平检测。鼻咽癌细胞株中LncROR的表达水平均高于鼻咽部上皮组织细胞NP69（P＜0.05,图2）。上述4种鼻咽癌细胞株中,LncROR在CNE-2中表达量最高。所以，我们选择CNE-2细胞株进行后续体外实验研究。

图1 采用实时荧光定量PCR检测LncRNA-ROR在鼻咽癌组织和鼻咽炎黏膜组织相对表达量。样本间数据分析采用配对t检验（n=15，*:P＜0.05）。

图2 采用实时荧光定量PCR检测鼻咽部上皮细胞株NP69和鼻咽癌细胞株 (CNE-2,HNE1,HONE-1,SUNE-1)中LncRNA-ROR相对表达量。数据分析采用均数±标准误，每组样本平均重复实验3次。与Mock组相比，*表示P＜0.05。

2 体外研究LncROR对鼻咽癌细胞增殖能力及凋亡相关蛋白的影响

用基因沉默方法抑制LncROR在CNE-2细胞中的表达。转染48小时后，提取细胞总RNA，用实时荧光定量PCR方法检测转染成功（P＜0.05，图3）

图3 采用实时荧光定量PCR检测，经RNA干扰后，鼻咽癌细胞株CNE2中LncROR表达含量。Mock组：空载转染对照组；sh-ROR:LncROR基因抑制组数据分析采用均数±标准误，每组样本平均重复实验3次。与Mock组相比，*表示P＜0.05。

经细胞增殖实验证实，抑制LncROR表达后，与转染对照组相比,细胞增殖能力明显减弱（P＜0.05，图 4）。用Western blot方法检测，LncROR 对凋亡相关蛋白表达变化 (活化caspase-3、caspase-3总蛋白、活化caspase-9蛋白、caspase-9总蛋白)。结果显示，抑制LncROR后，活化的caspase-3、caspase-9蛋白表达升高，但总蛋白的水平没有明显变化（P＜0.05，图5）。上述结果显示，LncROR表达下降可以减弱CNE-2细胞增殖能力,增加凋亡能力。

图4 CCK-8实验检测LncRNA-ROR表达沉默后细胞增殖能力改变。Mock组：空载转染对照组；sh-ROR:LncROR基因抑制组数据分析采用均数±标准误，每组样本平均重复实验3次。与对照组相比，*表示P＜0.05。

图5 Western blot方法检测，LncROR表达沉默后对凋亡相关蛋白表达影响。Mock组：空载转染对照组；sh-ROR:LncROR基因抑制组。左侧：Western印迹法检测条带图，右侧：统计图。数据分析采用均数±标准误，每组样本平均重复实验3次。与Mock组相比，*表示 P＜0.05,

3 LncROR促进CNE-2细胞发生上皮-间质转化

用Western blot检测，在CNE-2细胞中抑制LncROR后，对上皮-间质转化标志蛋白表达的影响。结果显示，抑制LncROR后，可以导致上皮标志蛋白（E-钙粘蛋白、β-连环蛋白）表达升高，间质标志蛋白（N-钙粘蛋白、波形蛋白）表达下降(P＜0.05，图6)。

图6 Western blot方法检测，LncROR表达沉默对上皮-间质转化相关蛋白表达影响.Mock组：空载转染对照组；sh-ROR:LncROR基因抑制组。E-cadherin:E-钙粘蛋白；β-catenin：β-连环蛋白；N-cadherin:N-钙粘蛋白；Vimentin:波形蛋白；GADPH为内参。左侧：Western印迹法检测条带图，右侧：统计图。数据分析采用均数±标准误，每组样本平均重复实验3次。与Mock组相比，*表示P＜0.05,

讨论

鼻咽癌中主要以低分化鳞癌为主，因其病变部位隐匿，早期不易被发现。故临床就诊患者约60%已出现颈部淋巴结转移，20%因颅神经受累而就诊，明显影响患者预后[1]。随着肿瘤学和分子生物学的发展，上皮-间质转化在肿瘤中所发挥的作用越来越受到关注。因此，研究鼻咽癌发生、发展的分子机制，寻找早期的诊断指标，对改善鼻咽癌预后有十分重要的意义。

LncRNA存在于细胞核和胞浆中，可在表观遗传、转录及转录后等多个层面参与基因调控[6]。近期研究发现，LncRNA在调节肿瘤增殖、凋亡以及上皮-间质转化中起重要作用。Richards等[7]研究发现LncRNA-HIT有促进乳腺癌细胞侵袭和迁移的作用，在下调LncRNA-HIT的表达后，上皮标志蛋白E-钙粘蛋白表达上调，间质标志蛋白波形蛋白表达下降。Ying等[8]在发生远处转移的膀胱癌组织中研究发现有LncRNA-MALAT-1高表达，下调MALAT-1表达后，上皮-间质转化调控因子ZEB1、ZEB2和Slug的表达下降，E-钙粘蛋白表达明显增高，其机调节制可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路促发了上皮-间质转化的发生。Liang等[9]研究发现，LncRNA-H19在间质样肿瘤细胞和肿瘤组织中高表达，LncRNA-H19可竞争性拮抗miR-138和miR-200A的功能，使波形蛋白、ZEB1和ZEB2表达上升，进而导致上皮-间质转化的发生。

LncROR是近期被证实的胚胎源性干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的重要调控因子，可维持ESCs及肿瘤干细胞的存活[4]。目前研究发现，LncROR在肿瘤的增殖及抗凋亡中同样发挥重要作用。近期研究表明，LncROR在多种肿瘤组织及细胞中异常表达，如肝癌、乳腺癌、胶质瘤等，且已证明其与肿瘤细胞的上皮-间质转化相关。Hou等[10]的研究表明LncROR在乳腺癌中的表达水平高于周围正常组织，并通过促进上皮-间质转化，提高乳腺肿瘤细胞的增殖及侵袭能力，类似的研究在肝癌和胶质瘤中也得到证实[11，12]。不可否认，LncROR在调控肿瘤细胞增殖、抗调亡及上皮-间质转化中的作用已在多种肿瘤中得到证实，但LncROR在鼻咽癌增殖、转移和上皮-间质转化中的作用尚无研究报道。

本实验采用实时荧光定量PCR方法检测鼻咽癌组织及慢性鼻咽炎组织中LncROR的表达情况，结果显示在鼻咽癌组织中LncROR的表达明显高于慢性鼻咽炎组织。初步表明LncROR的表达可能与鼻咽癌的发生、发展有一定的相关性。随后，我们在 CNE-2、HNE1、HONE-1、SUNE-1 四种鼻咽癌细胞株中用实时荧光定量PCR方法检测LncROR的表达，结果显示：在CNE2中LncROR高于其他三种鼻咽癌细胞株，所以我们选择CNE2作为后续LncROR的作用机制研究对象。

上皮-间质转化是肿瘤发生增殖转移的关键机制之一。LncROR已被证明在多种肿瘤细胞增殖和上皮-间质转化过程中具有重要作用[13-15]，其中E-钙粘蛋白和波形蛋白可作为肿瘤上皮-间质转化过程中最可靠的标志蛋白[16，17]。Hou 等[10]研究发现：LncROR在乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中的表达均有增高；并通过Western blot和免疫荧光法检测上皮-间质转化相关标志蛋白，发现调控LncROR表达水平后，E-钙粘蛋白(E-cadherin)和闭合蛋白(occludin)等上皮标志蛋白表达降低，而波形蛋白(vimentin)和N-钙粘蛋白(N-cadherin)等间质标志蛋白的表达增高；而且shRNA干扰LncROR后，波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达降低，说明LncROR可以通过调控上皮-间质转化促使乳腺癌的发生和转移。本研究结果证明，在抑制LncROR表达后，与对照组相比，CNE-2增殖能力明显减弱。而且我们用Western blot方法检测LncROR对凋亡相关蛋白表达变化，结果显示，抑制LncROR后，活化的caspase-3、caspase-9表达升高，上述结果表明，LncROR表达下降可以减弱CNE-2细胞增殖和抗凋亡能力。随后，我们还用Western blot方法检测了上皮-间质转化相关标志蛋白的水平改变，结果显示在LncROR表达抑制后，上皮标志蛋白E-钙粘蛋白、β-连环蛋白表达升高，间质标志蛋白N-钙粘蛋白、波形蛋白表达下降。结果证明，LncROR可促进鼻咽癌细胞发生增殖、抗凋亡及上皮-间质转化。

综上所述，LncROR在鼻咽癌组织中高表达，并可以促进鼻咽癌细胞发生增殖、抗凋亡及上皮-间质转化。随着基因组学研究水平的不断提高，人们对基因表达调控的认识也在持续提升，一些诸如LncROR等具有重要功能的LncRNA逐渐被发现[18-20]。随着该领域研究的不断深入，LncROR的研究有望从基础走向临床，成为鼻咽癌新的诊断指标及治疗靶点。