阿柏西普对大鼠视网膜Müller细胞STAT3表达的影响

雷琦峰，蔡 维

作者单位:(442000)中国湖北省十堰市，湖北医药学院附属东风医院眼科

0 引言

Müller细胞为一种贯穿视网膜全层的放射状胶质细胞，可与感光细胞以及其它的神经元紧密相连，可通过降解谷氨酸与摄取谷氨酸－天冬氨酸转运蛋白摄取，从而发挥保护神经元的作用［1－2］。同时 Müller细胞是一种损伤诱导的干细胞，周围环境的变化亦可影响Müller细胞功能［3－4］。绝大多数活化的Müller细胞都停留在幼稚阶段，但是当视网膜下腔胶质瘢痕一旦形成，组织低氧压引起视网膜血管和脉络膜毛细血管灌注不足，血－视网膜屏障被破坏，加剧感光细胞凋亡［5］。因此研究Müller细胞调节机制有助于促进Müller细胞向神经元的分化。信号转导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是一类DNA结合蛋白，广泛表达于不同类型的细胞和组织中，可参与细胞转化、凋亡、生长、恶性转化等过程［6－8］。阿柏西普是一种融合蛋白，其作为眼科一种新的抗血管生成物，利于减缓湿性黄斑水肿的进展速度，使机体中央视觉维持较长时间，其作用效能强于雷珠单抗或贝伐单抗［9－11］。本实验探讨了阿柏西普对大鼠视网膜Müller细胞STAT3表达的影响，希望为延缓视网膜色素变性疾病进程提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠永生化视网膜Müller细胞系购自美国Sigma公司(细胞培养在含有10%血清的DMEM培养基中，培养条件:5%CO2、37℃);DMEM细胞培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;Annexin V－FITC PI细胞凋亡检测试剂盒购于美国Invitrogen公司;MTT增殖检测试剂盒购于美国Promega公司;兔抗人多抗［抗AKT抗体(68kD)、抗STAT3抗体(114kD)、抗GAPDH抗体(42kD)］购自英国Abcam公司;HRP抗兔二抗购自英国Abcam公司;阿柏西普购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖 将对数生长期的Müller细胞分别接种于96孔培养板中，每孔细胞密度为1×104个/mL(100μL)。按实验分组，加入不同浓度的阿柏西普100μL(加药浓度分别为 400、200、100pg/mL)，继续培养24、48h 后加入 MTT 10μL，6h 后终止培养，每孔加入150μL DMSO，震荡10min后，使用酶标仪540nm波长处检测与计算增殖活性。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期Müller细胞，调整细胞浓度至1×103个/mL，接种于6孔培养板。给予阿柏西普处理48h后收取细胞，加入200μL结合缓冲液重悬细胞，加入10μL Annexin V－FITC和5μL PI双标记后，避光反应15min，采用流式细胞仪检测凋亡情况。

1.2.3 Transwell小室法检测细胞侵袭 将5μg基质胶铺于侵袭小室聚碳酯微孔膜的上表面，37℃放置30min。Müller细胞经阿柏西普处理48h后，在Transwell上室中分别添加细胞100μL，在下室加入到600μL培养基，培养48h后将其取出，固定并染色微孔膜下层细胞，在400倍光学显微镜下任意选取5个视野，对每个视野穿过微孔细胞数目进行计数，以侵袭穿透指数判定侵袭能力。

1.2.4 Western－blot法检测蛋白表达 Müller细胞经阿柏西普处理48h后，收取细胞消化后提取细胞总蛋白，每组取20μg蛋白进行SDS－PAGE电泳，转膜后过夜封闭，剪成对应大小的条带放入各含有抗AKT抗体、抗STAT3抗体、抗GAPDH抗体的孵育盒中(稀释比例为1∶1000)，4℃过夜，TBST洗涤后，再将膜置于相应种属的二抗中(稀释比例为1∶5000)，室温孵育1h，TBST洗涤后进行 ECL显色，检测 GAPDH、AKT、STAT3蛋白表达水平。

统计学分析:所有实验均独立重复3次，统计学分析采用SPSS23.0统计学软件进行分析，计量数据采用珋x±s表示，首先采用单因素方差分析进行三组间的比较，若存在差异，两两比较采用 LSD－t检验，检验水准为α=0.05。

表1 不同浓度阿柏西普不同时间细胞增殖活性的变化(，%)

表1 不同浓度阿柏西普不同时间细胞增殖活性的变化(，%)

注:aP＜0.05 vs 100pg/mL阿柏西普组;cP＜0.05 vs 200pg/mL阿柏西普组。

阿柏西普浓度(pg/mL) 24h 48h 400 28.29±6.10a，c 45.69±5.11a，c 200 43.22±4.19a 66.66±6.44a 100 72.29±5.98 90.82±4.91 F 16.498 22.777 P＜0.01 ＜0.01

表2 不同浓度阿柏西普细胞凋亡率和侵袭穿透指数的变化(，%)

表2 不同浓度阿柏西普细胞凋亡率和侵袭穿透指数的变化(，%)

注:aP＜0.05 vs 100pg/mL阿柏西普组;cP＜0.05 vs 200pg/mL阿柏西普组。

阿柏西普浓度(pg/mL) 细胞凋亡率 侵袭穿透指数400 44.58±2.58a，c 9.48±6.33a，c 200 23.19±1.09a 20.17±3.92a 100 5.09±3.11 37.78±2.19 F 19.444 9.222 P＜0.01 ＜0.01

图1 不同剂量阿柏西普作用后AKT和STAT3蛋白的表达。

2 结果

2.1 不同剂量阿柏西普作用后细胞增殖活性的变化 处理24、48h后，随着阿柏西普浓度的升高，Müller细胞的增殖活性下降，差异有统计学意义(P＜0.05，表1)。

2.2 不同剂量阿柏西普作用后细胞凋亡率的变化 处理48h后，随着阿柏西普浓度的升高，Müller细胞的凋亡率逐渐上升，Müller细胞的侵袭穿透指数逐渐降低，差异均有统计学意义(P＜0.05，表2)。

2.3 不同剂量阿柏西普作用后AKT和STAT3蛋白的表达 处理48h后，随着阿柏西普浓度的升高，Müller细胞的AKT蛋白相对表达量无显著变化(F=0.533，P=0.333);STAT3蛋白相对表达量逐渐降低，差异有统计学意义(F=9.30，P=0.001，图 1)，两组间比较，200pg/mL组和100pg/mL组、400pg/mL组差异均有统计学意义(t=8.294、10.482，P=0.012、0.001)。

3 讨论

Müller细胞对视网膜发育和维持自身平衡都具有重要的作用，当前视网膜损伤情况下，Müller细胞可重新回到细胞周期，能够大量活化和增殖，逆分化为视网膜干细胞，进而转分化为视网膜各类细胞和神经元，完全替代损伤的细胞，恢复视网膜功能［11］。但是在哺乳动物中，Müller细胞的功能受限，只有少量逆分化的Müller细胞分化表达视网膜神经元，并能特异地向感光细胞分化［12－13］。

VEGF及其受体(VEGFR)的生成过度表达参与视网膜的损伤过程，严重影响患者视力［14］。VEGF为血小板衍生生长因子(PDGF)家族的重要一员，可增加血管通透性与促进血管和淋巴管的生成，是血管内皮细胞内高度特异性的血管生长和渗透因子［15］。VEGF的类型包括VEGFA、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D 等，其是由七个免疫球蛋白样的结构域串联而形成的膜外部分，膜内部组成具有酪氨酸激酶活性［16］。VEGF是参与糖尿病黄斑水肿病理生理过程的重要因子，高血糖、缺氧、外在损伤等病理条件可导致VEGF的上调，从而引起血管增生、血管渗漏等一系列病理过程［17］。阿柏西普的配体结合域融合了来自VEGF受体1、2及IgG1的Fc部分，其作为一种可溶性诱导受体来结合VEGF－A和胎盘生长因子，抑制同源VEGF受体的结合和激活，且阿柏西普与VEGF的亲合力高，中和VEGF－A的效能强于雷珠单抗或贝伐单抗［18－19］。本研究显示细胞处理24、48h后，随着阿柏西普浓度的升高，Müller细胞的增殖活性下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。处理48h后，随着阿柏西普浓度的升高，Müller细胞的凋亡率逐渐上升，Müller细胞的侵袭穿透指数逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明阿柏西普的应用能降低Müller细胞增殖与侵袭性，提高细胞凋亡率。

当前研究表明，微环境中的细胞可通过分泌信号分子或者影响细胞间接触影响干细胞/祖细胞的存活、自我更新、迁移、粘附［20］。STAT3由 750～850个氨基酸组成，分子量为84～113kDa。编码STAT3的基因在人类定位于第12号染色体，在鼠科动物定位于第11号染色体。STAT3 mRNA在肝脏、睾丸、大脑、心脏和胸腺中含量较高，广泛表达于不同类型的细胞和组织中［21－22］。STAT3具有亮氨酸拉链结构(bZIP)，其与中枢神经系统疾病、眼科疾病等多种病理生理过程有着密切的关系［23－24］。STAT3既可抑制转录，也可活化转录，其在调控细胞增殖、凋亡、免疫稳态、炎症以及器官和组织的分化等方面具有重要功能。研究表明，当Müller细胞受损时细胞凋亡增加，凋亡相关标记物上调［25］。本研究显示处理48h后，随着阿柏西普浓度的升高，Müller细胞的AKT蛋白相对表达量无显著变化(P＞0.05)，STAT3蛋白相对表达量逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明阿柏西普的应用可影响STAT3蛋白的表达。从机制上分析，阿柏西普可阻止VEGF与Fit－1的结合，抑制同源VEGF受体的结合和激活，从而抑制STAT3蛋白的表达。本研究也有一定的不足，没有对阿柏西普的空白对照进行分析，也没有明确阿柏西普的作用位点，将在下一步的实验中进行深入分析。

总之，阿柏西普可抑制大鼠视网膜Müller细胞STAT3蛋白表达，从而抑制细胞增殖与侵袭性，促进细胞凋亡。