黄刺玫果总黄酮的水提取工艺

陈明文，郝晓倩，杨官娥，王进东

（1.山西医科大学，山西太原030001； 2.山西省医药与生命科学研究院，山西太原030006）

黄刺玫是野生落叶灌木，属于蔷薇科蔷薇属植物［1］，别名黄刺梅，广泛分布在我国北方的山区和丘陵地带［2］，山西省境内资源丰富。黄刺玫的花、果、叶和根皮均可入药，能治疗消化不良、腹痛腹胀或妇女月经不调，具有健脾养血、理气调经的功效［1］。现代研究表明，黄刺玫果实中含有丰富的黄酮、皂苷和植物SOD以及大量的微量元素和维生素［3］。黄刺玫果汁具有抗衰老和预防心血管病变的作用，机制和其对活性氧清除作用的加强以及减轻或阻断脂质过氧化作用相关［4］。毒理实验证明，黄刺玫安全无毒，黄刺玫果肉可作为天然抗氧化剂［5］，可作为药用或食用资源［6］。对于黄刺玫果已有少量相关药理研究报道，暂未见工业生产条件下的提取工艺报道。本实验研究黄刺玫果中总黄酮提取的最佳工艺条件，采用紫外分光光度法测定黄刺玫果总黄酮的含量，为工业上大规模提取黄刺玫果中总黄酮提供依据和参考。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

黄刺玫果采自山西山区，经单位阮文辉老师检测为黄刺玫果Rosa xanthina Lindle，粉碎过50目筛。

芦丁标准品（含量 HPLC：90.5%）购自中国药品生物制品检定所（批号：100080-200707）；无水乙醇、柠檬酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；蒸馏水，自制。

1.2 仪器与设备

UV757CRT型紫外-分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；FA2104S型电子天平，广州予华仪器有限公司；CHH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；RE-2000B型低温冷却循环泵和旋转蒸发器，杭州瑞佳精密科学仪器有限公司；LYNX6000型高速冷冻离心机，Thermo Fisher公司。

2 方法与结果

2.1 芦丁标准曲线的制备

按照药典中亚硝酸钠-硝酸铝法，以芦丁为对照品进行测定。

精密称取芦丁对照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用。以不加芦丁对照品溶液的容量瓶为对照，精密吸取芦丁对照品溶液0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为6.0 mL，分别再加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置 6.0 min；分别再加入 10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6.0 min；分别加入 1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，摇匀，加入30%乙醇至刻度，放置15 min。在510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程A=12.92C-0.009，R2为 0.999 8，在 8 g/mL～96 g/mL范围内线性关系良好。

2.2 黄刺玫果总黄酮的提取和测定

2.2.1 供试品溶液的制备 称取粉碎成粗粉的黄刺玫干果50.0 g，置于1000 mL圆底烧瓶中，按一定料液比加入蒸馏水浸泡1.0 h，放入70℃恒温水浴锅中回流提取一定时间，提取一定次数，合并提取液后定容到一定体积，摇匀，作为样品溶液。

2.2.2 样品中总黄酮的测定 精密吸取供试品溶液1.0 mL，按照药典中亚硝酸钠-硝酸铝法规定的前处理方法处理后进行紫外测定，得到含量后按下式计算相应的总黄酮得率（mg/g）。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取次数对总黄酮提取效果的影响 设定浸泡时间为 1.0 h，料液比 1∶8，提取温度为 70 ℃，提取时间为1.0 h，pH为7.0的条件下，考察提取次数对总黄酮提取效果的影响。即对单次水提取后抽滤得到的提取液进行含量测定，重复提取5次，比较这5份提取液中总黄酮含量的差异情况。实验结果表明，当重复提取次数为4次时，总黄酮得率已经很小，且继续增加提取次数，已经不能明显增加黄刺玫果总黄酮的提取效果。综合时间和效果方面考虑，最终确定重复提取3次为最适提取次数。结果见图1。

图1 提取次数对黄刺玫果总黄酮提取效果的影响

2.3.2 料液比对总黄酮提取效果的影响 设定浸泡时间为1.0 h，提取次数为3次，提取温度为70℃，提取时间为1.0 h，pH为7.0的条件下，考察料液比对黄刺玫总黄酮提取效果的影响。实验结果表明，料液比为1∶10时，总黄酮的提取效果较好。考虑到料液比过大带来的经济问题和后续处理因素，选择料液比为1∶10。结果见图2。

图2 料液比对总黄酮提取效果的影响

2.3.3 提取时间对总黄酮提取效果的影响 设定浸泡时间为 1.0 h，料液比为 1∶10，提取温度为 70 ℃，提取次数为3次，pH为7.0的条件下，考察提取时间对总黄酮提取效果的影响。试验结果表明，随意增加提取时间，提取时间为1.5 h后，总黄酮提取效果未见明显增加，故选择提取时间为1.5 h。结果见图3。

图3 时间对总黄酮提取效果的影响

2.3.4 温度对总黄酮提取效果的影响 设定浸泡时间为 1.0 h，料液比为 1∶10，提取次数为 3 次，提取时间为1.5 h，pH为7.0的条件下，考察提取温度对总黄酮提取效果的影响。实验结果表明，随着提取温度的升高，总黄酮的提取效果增加，提取温度为80℃时，总黄酮提取效果最好。结果见图4。

图4 温度对总黄酮提取效果的影响

2.3.5 pH对总黄酮提取效果的影响 设定浸泡时间为 1.0 h，料液比为 1∶10，提取温度为 80 ℃，提取时间为1.5 h，提取次数为3次的条件下，考察pH对总黄酮效果的影响。实验结果表明，随着pH的增加，黄刺玫果总黄酮提取效果先增加后减少。故选择pH为3.0作为水提取的pH条件。

图5 pH对总黄酮提取效果的影响

2.3.6 浸泡时间对总黄酮提取效果的影响 设定提取次数为3次，料液比为1∶10，提取温度为80 ℃，提取时间为 1.5 h，pH 为 3.0 的条件下，考察浸泡时间对黄刺玫果总黄酮提取效果的影响。试验结果表明，浸泡时间大于1.5 h后并不明显增加总黄酮得率，所以选择浸泡时间1.5 h作为提取条件。结果见图6。

3 正交试验

3.1 正交试验设计

图6 浸泡时间对黄刺玫总黄酮提取效果的影响

在以上单因素实验的基础上，结合参考文献［7-10］，在选定pH为3.0、提取次数为3次的前提条件下，考察提取温度A、料液比B、提取时间C作为正交试验因素，每个因素如表1所示设置3水平，按照L9（33）正交试验设计表，以总黄酮得率作为评价指标，对黄刺玫果中总黄酮的水提取工艺进行正交试验优化。结果见表1。

表1 黄刺玫果总黄酮提取工艺正交试验因素水平表

3.2 正交试验结果分析

结果见表2。

表2 黄刺玫果总黄酮的提取L9（33）正交试验设计及结果

由单因素试验和表2的正交试验结果表明，影响水提总黄酮的最主要因素是温度，其次是料液比。考虑到在温度提升及料液比增加的情况下，相应的成本和浓缩提取液的相关问题，结合总黄酮得率的相应差距，最终确定了黄刺玫果总黄酮的提取工艺为A2B2C2，也就是在pH为3.0的水中按1∶10的料液比在80℃的条件下进行提取，每次提取1.5 h，重复提取3次，总黄酮得率较高，成本合理。此工艺验证实验结果表明，在该提取工艺条件下，总黄酮平均得率为9.39 mg/g，对比叶松华等［7］的醇提黄刺玫果中总黄酮的工艺，用醇提法得到的总黄酮率为10.32 mg/g，两者相比无明显差异，考虑到工业上用醇提法可能存在的安全性以及液体回收和损耗的相应成本，故而水提法在工业生产上能带来更好的经济效益。

本实验得到了水提黄刺玫总黄酮的工艺条件为：浸泡时间1.5 h，料液比为 1∶10，提取温度为80 ℃，提取时间为 1.5 h，提取次数为 3 次，pH 为 3.0，总黄酮得率9.39 mg/g，具有可行性。为工业化提取黄刺玫果总黄酮提供了参考。