人参皂苷Rg3对大鼠颈动脉球囊损伤模型PCNA、CyclinD1及CDK4表达的影响

陈文明 蹇明辉 赵然尊 石蓓

(遵义医学院附属医院心血管内科，贵州 遵义 563099)

目前，经皮冠状动脉介入治疗(PCI)已成为冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病，CHD)治疗的重要措施之一，治疗效果明显。然而，PCI术后血管再狭窄的发生，严重影响患者的远期疗效〔1〕。因此，如何解决PCI术后血管再狭窄的问题，已成为CHD治疗的主要研究热点。既往研究已证实，在PCI术后血管再狭窄发生、发展的过程中，血管平滑肌细胞(VSMCs)过度增殖和迁移起着非常重要的作用〔2〕，如果能有效抑制其过度增殖和迁移，那么，PCI术后再狭窄的发生率就有可能得到有效的控制。人参皂苷 Rg3是从人参中提取的一种四环三萜皂苷类化合物，具有多种药理活性〔3〕。近年来研究表明，人参皂苷Rg3通过抑制肿瘤血管生成因子的信号传导途径，从而抑制肿瘤新生血管的形成〔4，5〕。本课题前期研究结果发现，人参皂苷Rg3可能通过促进平滑肌细胞凋亡、抑制炎症因子表达等方面减轻损伤后血管内膜增生〔6，7〕。本文拟探讨血管内膜损伤后，人参皂苷Rg3能否通过下凋增殖细胞核抗原(PCNA)的表达、抑制细胞周期蛋白(Cyclin)D1和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4的活性作用，从而减轻血管内膜增生。

1 材料和方法

1.1主要试剂和仪器 人参皂苷Rg3，纯度98%，购于上海笃玛生物科技有限公司；Real-Time PCR试剂盒和RNA逆转录试剂盒购于广州市锐博生物科技有限公司；蛋白抗体PCNA、CyclinD1、CDK4和β-actin购于北京博奥森生物技术有限公司；2.0 mm×12.0 mm球囊导管购于美国 Baxter Healthcare 公司；正置荧光电子显微镜购于日本Olympas 公司；PCR仪、酶标仪和凝胶成像系统分析仪均购于美国BIO-RAD公司。

1.2实验动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠30只(购自重庆腾鑫生物技术有限公司)，随机分为人参皂苷Rg3(10 mg/kg)组，模型组和假手术组，每组10只。假手术组只分离左颈总动脉，其余两组大鼠均进行球囊损伤。术后次日人参皂苷Rg3组开始灌胃给药，每日1次，连续14 d。

1.3模型建立 实验大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)经腹腔麻醉，再腹腔注射给予肝素钠(625 U/kg)，然后根据本课题组前期实验方法建立球囊损伤颈动脉模型〔6，7〕。为了预防大鼠术后发生感染，手术结束后给予青霉素(80万U)肌肉注射，1次/d，连续3 d。大鼠术后予普通饲料，自由饮水。

1.4苏木精-伊红(HE)染色 损伤血管组织用石蜡包埋，切片。经HE染色后，用正置荧光电子显微镜观察结果并拍照。拍摄结果用Image-pro Plus (IPP)图像分析软件测量损伤血管的内膜厚度、中膜厚度和血管管腔面积，计算内膜/中膜面积比。

1.5Western印迹法检测PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表达 颈动脉损伤血管组织用细胞裂解液提取总蛋白，然后用Bradford法测量样品浓度，调节蛋白上榜浓度。蛋白经凝胶电泳分离后用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转膜，将转好的PVDF膜放入脱脂奶粉封闭液进行封闭。加入一抗在4℃摇床上摇动孵育过夜，加二抗孵育1 h，加入化学发光显色剂，用BIO-RAD凝胶成像系统曝光，分析电泳条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.6Real-Time PCR检测PCNA、CyclinD1和CDK4 mRNA表达 颈动脉损伤血管组织用 Trizol一步法提取总RNA，测定RNA的纯度及浓度。采用两步法逆转录-聚合酶链反应，逆转录反应条件：(1)逆转录反应(37℃、15 min)，(2)逆转录酶的失活反应(85℃、5 s)，样本4℃冰箱保存。待确认引物的反应性和反应体系(25 μl)，进行PCR反应扩增，步骤：(1)预变性(1个循环)：95℃、1 min；(2)PCR反应(40个循环)：95℃、5 s，60℃、30 s退火，延伸；(3)融解曲线：95℃、10 s，55℃、1 min。待扩增反应结束后，CT值采用2-△△CT法进行分析，比较各组目的基因表达变化〔8〕。引物序列见表1。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0软件行t检验。

表1 引物序列和扩增产物长度

2 结 果

2.1人参皂苷Rg3对颈动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响 显微镜下观察，假手术组血管内膜光滑，未见明显增厚现象；模型组血管内膜较假手术组明显增加(P<0.01)，血管管腔面积减小，同时，内膜/中膜面积比也明显增加(P<0.01)；与模型组相比，人参皂苷Rg3组损伤血管内膜增厚的程度明显减轻(P<0.01)，血管管腔面积增大，内膜/中膜面积比显著下降(P<0.01)，差异均有统计学意义说明人参皂苷Rg3抑制球囊损伤后血管内膜增生，见图1、表2。

2.2人参皂苷Rg3对颈动脉球囊损伤后血管PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白及mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组损伤血管组织PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白及mRNA表达显著增加(均P<0.01)；与模型组比较，人参皂苷Rg3组损伤血管组织PCNA、CyclinD1及CDK4蛋白及mRNA表达明显降低(P<0.01)，见图2、表3。

图1 人参皂苷Rg3 对损伤后血管内膜形态学的影响(×100)

组别内膜面积(mm2)中膜面积(mm2)内膜/中膜面积比假手术组0.009±0.0010.094±0.0110.095±0.007模型组0.332±0.0311)0.108±0.0243.074±0.1631)人参皂苷Rg3组0.151±0.0362)0.104±0.0122)1.452±0.2152)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；下表同

图2 Western印迹法检测损伤血管组织PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白的表达

组别蛋白PCNACyclinD1CDK4mRNAPCNACyclinD1CDK4假手术组0.152±0.0100.253±0.0210.112±0.011102.5±17.399.7.4±10.9109.8.1±16.5模型组0.996±0.0381)0.928±0.3121)0.863±0.0551)442.5±33.31)366.2±29.71)513.2±42.11)人参皂苷Rg3组0.384±0.0312)0.313±0.0192)0.377±0.0282)190.7±21.32)161.5±21.92)246.1±28.92)

3 讨 论

PCI术后再狭窄的形成，主要是病变血管经球囊扩张后，血管内膜遭到机械性损伤，导致血管内皮细胞脱落；同时，在球囊扩张过程中，血管的拉伸和撕裂引起血管弹性回缩，导致损伤的血管局部出现氧化应激和炎症反应，甚至有血栓的形成；VSMCs过度增殖和迁移，加上细胞外基质也不断分泌聚集，从而引起血管内膜不断增厚，导致血管管腔狭窄〔9〕。PCNA是一种存在于细胞核内的多聚酶的辅助蛋白，在细胞中呈周期性变化。细胞处于静止期时，PCNA 基本不表达；细胞进入增殖期时，细胞中PCNA 合成与表达增强，与DNA的合成紧密相关〔10〕。因此，将PCNA作为评价细胞增殖状态及活性的重要有效指标之一。本研究通过建立颈动脉球囊损伤模型，观察人参皂苷Rg3对血管内膜增生的影响，结果提示人参皂苷Rg3可以抑制细胞增殖，具有减轻血管内膜增生的作用。

CyclinD1 是G1期细胞周期素，是细胞从G1期进入S期促进细胞分裂增殖的关键调控因子。CyclinD1与细胞周期依赖性激酶CDK4 结合，促进下游的Rb蛋白的磷酸化；此时，受Rb蛋白调控的转录激活因子E2F被释放，促使一些与DNA复制有关的酶蛋白基因得以表达，从而启动细胞DNA的复制，缩短细胞周期，导致细胞周期调节失控，细胞异常增殖〔11〕。近年研究发现，损伤血管组织中的 CyclinD1、CDK4表达率明显高于正常的血管组织，推断在血管再狭窄的发生发展过程中，CyclinD1、CDK4 蛋白的呈过度表达〔12，13〕。

本实验利用Western印迹和Red-Time PCR检测结果发现，人参皂苷Rg3可以抑制球囊损伤后颈动脉CyclinD1、CDK4的表达，从而抑制血管新生内膜增生。综上所述，人参皂苷Rg3能抑制大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生，其机制可能与下凋PCNA表达、抑制细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4活性有关，但其发挥作用的具体机制尚不明确，有待深入研究。