高碳基肥对烤烟生长及土壤微生物碳代谢多样性特征的影响

张志浩，陈思蒙，任天宝，丁松爽，李 阳，王欢欢，云 菲，刘国顺

（河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州 450002）

烤烟是我国重要的经济作物之一，但长期以来烤烟种植大量不合理施用化肥，加之烤烟规模化和集约化生产，烟田连作现象愈加突出［1-2］。长期大量施用化肥和连作造成植烟土壤板结酸化［3］、肥力下降［4］、微生物区系改变［5］和病虫害加剧［6］等诸多问题，最终导致烤烟生长发育受阻、产质量降低等问题持续加重。微生物是土壤生态系统中最活跃的组成部分，对影响作物生长的物质循环、氧化分解和生理生化代谢等过程有重要作用［7］，微生物碳源代谢多样性也是衡量土壤质量、能量流动和生态系统稳定性的重要生态学指标。大量研究表明，土壤微生物群落调控失衡、数量减少和多样性降低是影响土壤连作障碍的重要因子之一［8-9］，因此就如何改善植烟土壤微生态环境以调控微生物群落构成和多样性对植烟土壤改良具有重要意义。生物炭是指由木头、秸秆或动物粪便等生物有机材料在低氧或缺氧环境中经高温裂解后形成的产物，由于其含碳量丰富、高度的稳定性和较强的吸附能力，在农业生产中的应用一直是研究热点［10］。国内外研究表明，生物炭能通过改善土壤酸碱度等物理性质、提高土壤养分和对有毒物质的吸附等途径增加土壤微生物量和群落功能多样性［11-12］。高碳基肥是一种以生物炭为主要原料的新型有机肥料，从现阶段的研究成果来看，高碳基肥在改良植烟土壤理化性状、提高养分含量、促进烤烟生长和改善烤烟品质等方面成绩斐然［13-14］。近年来，高碳基肥的应用研究大多在烤烟生长生理特性和产质量等方面开展，“土壤-生物炭-微生物”系统中碳源代谢及影响鲜有报道，而生物炭介导的土壤微生态环境调控正是植烟土壤改良的关键。为此，本文以典型浓香型烤烟和许昌烟区植烟土壤为研究对象，采用Biolog-ECO微平板法研究了高碳基肥对植烟土壤微生物碳代谢多样性特征的影响，并结合烤烟生长、土壤理化性质和烤后烟叶产质量等指标，探讨施用高碳基肥对植烟土壤碳代谢影响的生物学机制，为高碳基肥改良植烟土壤微生态环境的应用提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年在河南农业大学许昌试验农场进行，当地海拔79 m，地理坐标为34°7′56.38″N，113°48′19.95″E。试验地地势平坦，土壤肥力均匀，前茬作物为烟草。供试土壤类型为褐土，质地为砂壤土，其基础理化性质为pH值6.28，有机 质 20.79 g/kg， 碱 解 氮 69.04 mg/kg， 有 效 磷10.59 mg/kg，速效钾 138.89 mg/kg。供试烤烟为烟草品种“中烟100”，由许昌烟叶工作站提供。供试用高碳基肥为实验室自主研制，主要成分为生物炭≥200.00 g/kg，有机质≥45.00%（主要为油料饼肥），N∶P2O5∶K2O=2∶1∶2。

1.2 试验设计

采用随机区组试验设计，共4个处理：不施用高碳基肥（CK）；施用高碳基肥0.9 t/hm2（T1）；施用高碳基肥1.5 t/hm2（T2）；施用高碳基肥1.8 t/hm2（T3）。每个处理重复3次，共12个小区，每小区面积约0.067 hm2。每处理小区均以施纯氮80 kg/hm2计，氮磷钾比为1∶1.5∶3，其中对照处理施用烟草专用复合肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶20）300 kg/hm2，芝麻饼肥（N∶P2O5∶K2O=3∶2∶1）450 kg/hm2，硫酸钾（K2O 50%）150 kg/hm2，硝酸钾（N∶P2O5∶K2O=13.5∶0∶44.5）75 kg/hm2，磷酸二铵（N∶P2O5∶K2O=18∶46∶0）75 kg/hm2，高碳基肥处理按照氮素施用量一致的原则做相应调整，磷钾不足的以重过磷酸钙（P2O544%）和硫酸钾（K2O 50%）补齐。烟苗于4月25日移栽，肥料于移栽前一天起垄时条施，其它田间管理措施按当地优质烤烟栽培技术规范［15］进行。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 烤烟生长指标测定

烤烟进入成熟期（移栽后75 d）进行烟株农艺性状指标调查，参照 YC/T 142-2010标准［15］，随机选择每小区代表性烟株5株测定株高、茎围、节距、最大叶长和最大叶宽等农艺性状指标，最大叶面积=最大叶长×最大叶宽×0.634 5，0.634 5为烤烟叶面积指数。将所选烟株整株挖出，用自来水将根系冲洗干净后把地上部和根系分开，于105 ℃杀青15 min，后在65 ℃烘干至恒重测定部位干重。

1.3.2 土壤理化性质测定

将调查农艺性状烟株挖出后，轻轻抖落根系周边土壤，对根际土壤进行剔除石块、杂物等简单处理后置于低温箱内迅速带回实验室，土壤样品置于4℃冰箱内保存。使用自动pH计（Mettler-Toledo，瑞士）测定土壤pH值；采用烘干法［17］测定土壤含水率；参照陈安强等［18］方法，采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定土壤有机碳和微生物量碳氮指标。

1.3.3 土壤微生物多样性测定

根际土壤微生物碳源代谢多样性测定采用Biolog-ECO微平板法进行，具体操作流程及相关指数计算参照文献［19］，微生物群落多样性指数和碳源利用能力计算选取培养120 h的各孔在590 nm波长下的光吸收值。

Biolog-ECO微平板中平均颜色变化率（AWCD）表示土壤微生物代谢活性，计算公式如下：

AWCD=∑（Ci-Ri）/n。

式中：Ci为有碳源孔吸光值，Ri为对照孔吸光值，n为培养基孔数，此处n为31。

采用丰富度指数、多样性（Shannon-Winner）指数、优势度（Simpson）指数和均匀度（McIntosh）指数表征土壤微生物群落功能多样性。计算公式如下：

式中：Pi为第i孔相对吸光值与整板相对吸光值总和的比值（Ci-Ri）/∑（Ci-Ri）；ni为第i孔相对吸光值（Ci-Ri）。

以每一类碳源平均吸光值表征碳源利用率，计算公式如下：

式中：（Ci-Ri）为在j类碳源中，第i种碳源的相对吸光值；nj为所有属于j类碳源的孔数量。

1.3.4 烤后烟叶化学成分测定

采烤结束后，选取每小区C3F等级烤后烟叶进行常规化学成分含量和协调性测定。使用San++连续流动分析仪（Skalar，荷兰）测定烟叶总糖、还原糖、总氮、烟碱和氯含量；使用火焰光度计（FP6432，上海）测定烟叶钾含量；化学协调性指标糖碱比=总糖/烟碱，氮碱比=总氮/烟碱，钾氯比=钾/氯。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2010进行整理，利用SPSS 21.0统计分析软件进行方差分析和主成分分析（PCA），数据多重比较采用Duncan法，结果采用 Sigmaplot 12.0 及 Origin 9.0 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 高碳基肥对烤烟生长指标的影响

烤烟农艺性状是生长发育状况和协调性的直观体现，不同处理下烤烟生长指标如表1所示。与对照相比，施用高碳基肥处理下烤烟各生长指标均有不同程度提高。除节距和根系干重外，不同处理下烤烟生长指标均呈现出T2>T1>T3>CK的趋势，而且施用高碳基肥处理下烤烟株高、茎围、最大叶面积和根系干重等指标均显著高于对照处理（P＜0.05）。不同高碳基肥施用量下，以T2处理各指标表现最高，烤烟株高、茎围、最大叶面积、节距、地上部干重和根系干重等指标较对照处理分别显著提高了18.44%、5.76%、10.59%、9.73%、10.91%和81.67%。T3处理下烤烟各生长指标相对于T2处理均有所降低，且两处理间各指标差异均显著（P＜0.05）。从以上分析可以看出，施用高碳基肥能显著促进烤烟生长，但不同施用量下对烤烟生长的促进效果不尽相同。随着高碳基肥施用量的增加，烤烟生长指标大体上表现为先升高后降低的趋势，说明高碳基肥对烤烟生长的促进具有剂量效应，高碳基肥施用量以T2处理为宜。

表1 高碳基肥对烤烟生长指标的影响

2.2 高碳基肥对植烟土壤理化性质的影响

土壤理化性质及微生物量碳氮是影响土壤物质转换、能量流动和生物化学循环的重要因子，是土壤利用后养分结构变化和微生态进程的指示计［20］。从表2可以看出，与对照处理相比，施用高碳基肥处理下植烟土壤pH值、可溶性有机碳、微生物量碳和微生物量碳氮比均有不同程度提高，而含水率和微生物氮有所降低。施用高碳基肥的T1、T2和T3处理下土壤pH值较对照分别提高了0.22、0.23和0.26，且差异均显著（P＜0.05），但不同施肥量处理之间差异并不显著；随着高碳基肥施用量的增加，土壤含水率较对照分别减少了1.88%、1.98%和1.28%，但不同施肥量处理之间差异并不显著；施用高碳基肥后土壤微生物量碳虽有增加，可能由于重复间误差较大导致各处理间差异并不显著；土壤微生物量氮随着高碳基肥施用量的增加而逐渐降低，而T1和T2处理与对照相比差异并不显著，但T3处理下土壤微生物量氮含量较对照显著降低了43.47%；随着高碳基肥施用量的增加，土壤微生物量碳氮比呈现逐渐增加的趋势，与对照相比，T1处理微生物量碳氮比增加差异并不显著，而T2和T3处理较对照分别显著提高了64.31%和78.66%。以上分析说明，施用高碳基肥对植烟土壤理化性质的影响主要体现在pH值、含水率和微生物量碳氮比等指标上，对土壤有机碳、微生物量碳和微生物量氮含量的影响只有在高碳基肥施用量较高时才有显著作用。

表2 高碳基肥对植烟土壤理化性质的影响

2.3 高碳基肥对植烟土壤微生物多样性的影响

2.3.1 高碳基肥对土壤微生物AWCD的影响

Biolog-Eco微平板中31孔平均吸光度值变化（AWCD）是反映土壤微生物碳源利用能力和活性的有效指标［21］。从图1可以看出，随着培养时间的增加，不同处理下土壤微生物AWCD值呈现逐渐增加的趋势。自培养开始至120 h为AWCD值迅速上升期，说明土壤微生物对碳源的利用率快速增加，120 h以后各处理平均颜色变化率逐渐保持稳定，变化不大。在整个培养期内，各处理AWCD值表现为T2>T1>CK>T3的格局且一直存在。在120 h时，T1和T2处理下AWCD值较对照分别显著提高了11.18%和14.91%，但T1和T2处理间AWCD值差异并不显著。而T3处理下AWCD值则显著低于对照处理，降幅达10.56%。说明施用高碳基肥能显著影响植烟土壤微生物代谢活性，而且其效应与高碳基肥的施用量关系密切。在适量高碳基肥施用条件（T1和T2）下，土壤微生物代谢活性显著高于对照，但较高施用量（T3）下土壤微生物代谢活性较对照显著降低，说明使用高碳基肥对土壤微生物碳源利用能力的提高并非施用量越高效果越好，需要控制在合理范围内施用。

图1 高碳基肥对土壤微生物AWCD的影响

2.3.2 高碳基肥对土壤微生物群落多样性指数的影响

根据图1所示不同处理碳源利用情况和变化趋势，选取120 d的AWCD值进行土壤微生物群落碳源代谢多样性分析。丰富度指数能够反映不同处理下土壤微生物所利用的碳源数目状况，Shannon-Winner指数能够反映微生物群落分布均匀程度，Simpson指数能够反映微生物群落中物种的优势度，McIntosh指数是衡量微生物群落物种均一性的指标［22］。从表3可以看出，施用高碳基肥对植烟土壤微生物群落多样性指数影响较大，整体上呈现出T2>T1>CK>T3的趋势。与对照相比，T1和T2处理下土壤微生物群落丰富度指数和McIntosh指数及T2处理下Shannon-Winner指数均显著增高，而T3处理下除Simpson指数均显著低于对照处理。在Simpson指数上，不同高碳基肥施用量间虽呈现出先升高后降低的趋势，但与对照处理相比差异均不显著，说明施用高碳基肥对植烟土壤微生物群落Simpson指数的影响并未达显著水平。而在丰富度指数、Shannon-Winner指数及McIntosh指数上均以T2处理最高，T3处理显著较低。以上分析结果说明，适宜施用量的高碳基肥添加对植烟土壤微生物群落多样性指数有显著的促进作用，但施用量过高会造成丰富度指数、Shannon-Winner指数及McIntosh指数锐减，对植烟土壤微生物群落多样性产生抑制作用。

表3 高碳基肥对土壤微生物群落多样性指数的影响

2.3.3 高碳基肥对土壤微生物群落碳源利用率的影响

Biolog-ECO微平板由对照孔和31种不同单一碳源孔组成，其中碳源被分为碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类、胺类、聚合物类和酚类6大类，通过不同类碳源吸光度值变化可以探明土壤微生物对不同类碳源的利用特征［23］。从图2可以看出，对照处理中各类碳源中以聚合物类、碳水化合物类和羧酸类碳源利用率最高，说明此类碳源是土壤微生物的偏好类型。施用高碳基肥后，土壤微生物对各类碳源的利用特征发生了改变，而且不同高碳基肥施用量对土壤微生物碳源利用的影响规律不尽相同。低施用量高碳基肥（T1和T2）处理下，土壤微生物对碳水化合物类、氨基酸类和胺类碳源利用率较对照处理均有显著提高。与对照相比，高施用量高碳基肥（T3）处理下土壤微生物所利用碳源类型中仅有氨基酸类显著升高，而碳水化合物类、羧酸类、胺类、聚合物类和酚类碳源利用率均显著降低，说明施用高碳基肥对土壤微生物碳源利用率的提高在不同施用量处理间有明显差异，整体上以T2处理下微生物碳源利用率提高最为显著，而T3处理下则较对照显著降低。在不同碳源利用特征上，施用高碳基肥后土壤微生物利用率较高的碳源依次为氨基酸类、聚合物类、碳水化合物类和羧酸类，说明适量施用高碳基肥对土壤微生物碳源利用率的提高是通过上述类型碳源实现的。与对照相比，施用高碳基肥后土壤微生物对碳源的利用特征有所改变，且因高碳基肥的施用量不同有一定差异。整体而言，适宜施用量的高碳基肥能有效促进土壤微生物碳源利用率，而较高施用量高碳基肥对土壤微生物碳源利用有显著的抑制作用。

图2 高碳基肥对土壤微生物群落碳源利用率的影响

2.3.4 土壤微生物对碳源代谢的主成分分析

Biolog-ECO微平板上包含了6大类共31种碳源，有较多变量，选用主成分分析探究高碳基肥对植烟土壤微生物碳源利用模式和代谢特征。采用培养120 h后的各处理AWCD值对不同处理土壤微生物碳源代谢特性进行分析，通过PCA转换将不同处理的多元向量置换为互不相关的主元向量，利用各处理在空间位置上的差异与聚集形象直观地反映出不同微生物群落对碳源的代谢特点，客观准确地解释不同处理土壤微生物对碳源利用的多样性［24］。如图3所示，在31种因子中共提取了3个主成分因子，第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）和第三主成分（PC3）分别可解释所有变量的35.25%、27.86%和23.64%，3个主成分累积方差贡献率达到85%以上，可以用来概括31个变量的特征。从图3可以看出，不同处理中以T1和T2处理以及CK和T3处理得分接近，T2处理和CK得分距离相差较大。说明T1和T2处理以及CK和T3处理土壤微生物对碳源利用特征相似，而T2处理和CK处理土壤微生物碳源利用多样性相差较大。而且与CK相比，T1、T2和T3处理得分间均有较好的分散，在得分上表现为T2>T1>CK>T3的格局分布。可见，施用高碳基肥对土壤微生物碳代谢功能群结构和特征有较大影响，低施用量（T1和T2）处理下微生物对碳源的利用方式比较接近，而对照和高施用量（T3）处理碳源利用特征相似。从不同施用量处理得分空间位置可以看出，高碳基肥的施用改变了土壤微生物对碳源种类的利用模式，而且T1和T2处理下得分较高，说明适宜施用量的高碳基肥增强了土壤微生物对碳源的利用，而高施用量高碳基肥处理得分相比于对照更低，说明土壤微生物活性有所减弱。

图3 土壤微生物对碳源代谢的主成分分析

2.4 高碳基肥对烤后烟叶化学成分的影响

烤烟是一种嗜好类叶用经济作物，烤后烟叶内各种化学成分的数量和协调性是影响烤烟内在品质的重要因素。常规化学成分作为鉴定烟叶品质的指标要有适宜含量，一般认为，优质烤烟C3F等级烟叶总糖含量在22%～28%之间，还原糖含量在15%～20%之间，总氮含量在2.5%左右，烟碱含量在2%左右，钾含量在2%以上，氯含量控制在1%以下［25］。从表4可以看出，与对照相比，施用高碳基肥处理下烤烟总糖、还原糖、总氮、烟碱、钾和氯含量均有不同程度提高，但不同施用量间各指标增加存在一定差异。随着高碳基肥施用量的增加，烟叶总糖、还原糖和钾含量显现出先升高后降低的趋势，而总氮、烟碱和氯含量均为逐渐升高的趋势。总糖、还原糖和钾含量最高的T2处理较对照分别显著提高了22.81%、35.72%、25.61%，总氮、烟碱和氯含量最高的T3处理较对照分别显著提高了29.78%、74.74%和28.57%。但从常规化学指标适宜含量上看，T3处理下烤烟还原糖和烟碱含量较适宜范围均较高，相对来看以T1和T2处理下烤烟常规化学成分较适宜。在化学成分协调性上，一般认为糖碱比在6～10之间，氮碱比在0.8～0.9之间，钾氯比大于4较适宜［25］。从表4可以看出，与对照相比，施用高碳基肥处理下烤烟糖碱比和氮碱比均有不同程度降低，钾氯比在不同施用量间表现不一致，具体表现为T1和T2处理下钾氯比升高，而T3处理下钾氯比降低。从化学成分协调性的适宜性来看，T1和T3处理下烟叶氮碱比较低，而T3处理下钾氯比又相对较低，高碳基肥施用处理下烟叶糖碱比都较适宜。从以上分析可以看出，施用高碳基肥对改善烤后烟叶常规化学成分含量和协调性有显著作用，但不同施肥量间差异较大，以T2处理下烤后烟叶化学成分指标表现最好。

表4 高碳基肥对烤烟常规化学成分的影响

3 讨论

3.1 高碳基肥对烤烟生长和土壤理化性质的影响

土壤营养物质和环境是烟株正常生长的基础，高碳基肥是一种以生物炭为主要成分的新型有机肥料，在改良土壤理化性质、促进烟株生长等方面研究较多。张子颖等［14］研究表明，施用适量高碳基肥能显著提高烤烟株高、茎围、叶面积和生物量，这与本试验结果一致。高碳基肥料能有效提高土壤肥力，促进作物根系下扎，改善烟株农艺性状，而过量施用则对烟株生长发育具有一定的负效应［26］。有研究认为，生物炭特殊的孔状结构能降低土壤水分流失，从而提高土壤含水率［27］。但也有研究指出，高碳基肥料对土壤含水率的影响很大程度上由土壤类型和本身条件所决定。本试验中，施用高碳基肥造成植烟土壤含水率有所降低，可能是由于试验地土壤含水率较高，高碳基肥料施入后造成土壤物理结构改变，从而导致含水率下降［28］。研究表明，高碳基肥料本身含有一定的灰分元素，施用后能够有效提高土壤酸性盐基饱和度，进而降低交换性阳离子含量，提高土壤pH值［29］。本试验中施用高碳基肥料显著降低了土壤微生物量氮含量，并提高了微生物量碳氮比，说明高碳基肥料的施用导致了土壤微生物群落发生变化，对土壤碳氮循环和生态系统有一定影响［30］。

3.2 高碳基肥对土壤微生物碳源代谢多样性的影响

通过Biolog-ECO微平板培养法，研究不同处理下土壤微生物碳源利用方式和代谢特征。在216 h培养期间，不同处理下AWCD值均表现为低施用量>对照>高施用量的格局，说明施用适量高碳基肥能有效提高土壤微生物代谢活性和碳源利用效率［31］。施用适量高碳基肥能有效提高土壤微生物群落碳源利用丰富度、群落均匀度和均一性，而施用量过高会造成丰富度指数、Shannon-Winner指数及McIntosh指数锐减。施用适量高碳基肥提高土壤微生物碳源利用率主要通过氨基酸类、聚合物类、碳水化合物类和羧酸类碳源实现，而高施用量处理显著降低了土壤微生物碳源利用率。可能是施用适量高碳基肥提高了土壤肥力，同时生物炭提供的碳源促进了土壤微生物的代谢活性［32］，但随着施用量的增加，微生物群落间的竞争导致部分不能充分利用碳源的微生物种群活性降低［33］。主成分分析结果表明低施用量（0.9和1.5 t/hm2）处理下微生物对碳源的利用方式比较接近，而对照和高施用量（1.8 t/hm2）处理碳源利用特征相似，而且低施用量处理得分较高，说明高碳基肥的施入显著改变了土壤微生物活性，但土壤微生物活性和对碳源的利用在高施用量处理下反而降低，这与邓娇娇等［24］研究结果一致。施用适量高碳基肥能有效提高土壤微生物活性和丰度，可能是由于其多孔结构为土壤微生物提供了良好的栖身场所，同时生物炭表面含有的功能基团能有效吸附土壤易矿化有机碳和NH4+，而高施用量的高碳基肥可能由于乙稀、重金属和多环芳烃等物质含量较高不利于土壤微生物生长，抑制其生长和定殖［34-35］。

3.3 高碳基肥对烤后烟叶品质的影响

烤后烟叶内在品质与常规化学成分含量及协调性关系密切。叶协锋等［26］研究认为，施用适宜量生物炭能有效提高烤后烟叶烟碱、钾和氯含量，而在高施用量下反而不利于烤后烟叶品质的形成。这与本试验结果类似，同时本试验中烟叶总糖、还原糖和总氮含量亦随着高碳基肥的施用量增加有所提高，这与郑加玉等［36］研究结果有一定差异，可能是由于生物炭材料不同及土壤自然环境差异造成的。烤后烟叶化学成分对内在品质的影响并不仅仅由其含量所决定，各化学成分之间的关系调节往往决定着烤后烟叶风格和质量。本试验中，施用高碳基肥对改善烤后烟叶常规化学成分协调性有显著作用，但不同施肥量间差异较大，以1.5 t/hm2施用量下化学成分更为协调。

4 结论

综上所述，施用高碳基肥对烤烟生长、土壤微生物多样性及烟叶品质有显著影响，但高碳基肥对烤烟生长和品质的影响存在“抑制浓度”，许昌烟区最适宜施用量为1.5 t/hm2。高碳基肥的施用可能主要是通过改变植烟土壤理化性质，间接作用于土壤微生物群落组成，进一步影响烟株生长和产质量形成，但“土壤-生物炭-微生物”这一系统容易受到土壤自然条件、高碳基类型及试验条件的影响，高碳基肥对土壤微生物、烟株生长的相互联系和影响机制仍需要进一步探讨。