广西不孕不育人群α-地中海贫血基因分型与筛查结果分析

唐兰艳 吕福通 柳青 陈一君 谢丹尼

广西壮族自治区卫生计生委生殖中心（南宁530021）

α-地中海贫血（alpha-thalassemia，α-地贫）是一种常染色体隐性遗传病，以小细胞低色素性贫血为主要特征，其发生机制主要是由于α-珠蛋白基因缺陷导致其合成的量部分减少或完全缺失。α+地贫为仅一条染色体上的一个α 基因发生缺失或突变，α 链合成部分受到抑制；α0地贫为一条染色体上的两个α 基因均发生缺失，完全无α 链合成，故临床上α-地贫患者的严重程度与α 基因缺陷的数量有关［1］，其中血红蛋白H 病（hemoglobin H disease，HbH 病）与血红蛋白Bart's 胎儿水肿综合征（hemoglobin Bart's hydrops fetalis syndrome，Hb Bart's）对α-地贫患者的危害最大。α-地贫作为全球最常见的单基因遗传病，在地中海地区、中东、北非以及东南亚国家等多见，而在我国主要分布于广西和广东等地［2］。为了提高广西不孕不育人群进行体外受精-胚胎移植（In-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）前以及孕期保健质量，开展α-地贫筛查、基因诊断、产前诊断以及遗传咨询等可有效预防或减少α-地贫患儿出生。本文对到我中心就诊的10 020 例不孕不育者进行血液学参数、血红蛋白电泳以及基因检测，研究分析该人群α-地贫携带率、基因分型与基因频率分布等情况，可为广西不孕不育人群α-地贫患者进行IVF-ET 提供依据或数据支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月1日至2018年1月31日到我中心就诊并进行地中海贫血筛查和基因检测的不孕不育者10 020 例，其中男2 799例，年龄（35.9 ± 6.3）岁；女7 221 例，年龄（34.0 ±5.0）岁。就诊的不孕不育人群绝大多数来自广西各市县及镇，少数来自省外。

1.2 方法

1.2.1 研究策略 所有研究人群空腹8 h 以上并于次日早晨采集外周静脉血进行血细胞学分析，根据《广西婚前保健和孕期保健地中海贫血筛查与诊断技术规范（试行）》通知要求，筛查阳性标准为红细胞平均体积（mean corpuscular volume，MCV）＜82 fl 和（或）红细胞平均血红蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）＜27 pg。筛查阳性者再结合血红蛋白电泳结果，对血红蛋白A2（hemoglobinA2，HbA2）＜2.8%者以及临床医师怀疑为α-地贫而上述筛查实验阴性的部分人群进行α-地贫基因诊断。另外HbA2＞3.5%和（或）胎儿血红蛋白（hemoglobin F，HbF）＞2%者初诊为β-地贫，另行β-地贫基因诊断，不纳入本研究中。

1.2.2 血液学检测 使用Sysmex-XS-800i 全自动血液分析仪（希森美康公司，日本）测定MCV、MCH、平均红细胞血红蛋白浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）等红细胞参数；采用Sebiacapillarys 2（Sebia 公司，法国）检测HbA2和HbF。所有项目均在室内质控在控的条件下进行样本检测。

1.2.3 基因检测 采用核酸提取试剂（离心柱型）进行基因组DNA 提取，试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司提供；使用Gap-PCR 技术测定缺失型α-地贫，试剂购自深圳益生堂生物企业有限公司；采用PCR-反向点杂交法测定非缺失型α-地贫，试剂购自亚能生物技术（深圳）有限公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据处理分析，计量资料以（x ± s）表示，比较采用t检验，计数资料以例数或百分比表示。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 α-地贫基因分型及基因型频率 在10 020 例不孕不育受检者中，通过基因诊断共检出α-地贫患者624 例，检出率为6.23%；共检出19 种基因型，其中以轻型--SEA∕αα 为最常见，其次为静止型-α3.7∕αα 和αCSα∕αα。结果还显示，在基因型分别为--SEA∕αα、-α3.7∕αα 和αCSα∕αα 的患者中，男性与女性的构成比差别不大。见表1。

2.2 3种α-地中海贫血表型血液学参数及血红蛋白电泳结果 静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者MCV 均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者MCV 均高于轻型及中间型（均P＜0.05），轻型α-地贫男、女患者MCV 与中间型差异无统计学意义（均P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者MCH 均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者MCH 均高于轻型及中间型（均P＜0.05），轻型α-地贫女患者MCH 高于中间型女患者（P＜0.05），轻型α-地贫男患者MCH 与中间型男患者差异无统计学意义（P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者MCHC 均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者MCHC 均高于轻型及中间型（均P＜0.05），轻型α-地贫男、女患者MCHC 与中间型差异无统计学意义（均P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者Hb 均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者Hb 均高于轻型及中间型（均P＜0.05），轻型α-地贫女患者Hb 高于中间型女患者（P＜0.05），轻型α-地贫男患者Hb 与中间型男患者差异无统计学意义（P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者RBC 均高于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者RBC 低于轻型男、女患者（均P＜0.05），静止型α-地贫女患者RBC 低于中间型女患者（P＜0.05），静止型α-地贫男患者RBC 与中间型男患者以及轻型α-地贫男、女患者RBC 与中间型差异均无统计学意义（均P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者红细胞压积（hematocrit，HCT）均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者HCT 均高于轻型及中间型（均P＜0.05），轻型α-地贫女患者HCT 高于中间型女患者（P＜0.05），轻型α-地贫男患者HCT 与中间型男患者差异无统计学意义（P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者HbA2均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），静止型和轻型α-地贫男、女患者HbA2均高于中间型（均P＜0.05），静止型α-地贫男、女患者HbA2与轻型差异无统计学意义（均P＞0.05）。静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者HbF 之间以及他们与非地贫男性、女性比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表1 不孕不育人群α-地中海贫血基因分型及分布Tab.1 The distribution of genotypes and genotyping for infertile subjects with alpha-thalassemia

3 讨论

α-地贫从表型上可分为静止型、轻型、中间型或HbH 病和重型或Hb Bart’s 胎儿水肿综合征，各型的临床表现存在较大不同，比如α-地贫患者的Hb 浓度可从正常至严重贫血（Hb 75 ～155 g∕L），MCV ＜79 fl，MCH ＜27 pg，红细胞计数可正常或增高（RBC 6 ～7 × 1012∕L），HbA2%结果正常或轻度降低（正常人参考范围2.0% ～3.3%）［3］，这取决于非功能性α 基因的数量，可因α 和β 链、β-地贫和多个α 基因引起的血红蛋白变异体之间相互作用的多样性而导致α-地贫个体结果的差异性。本研究通过比较不孕不育人群α-地贫三种表型血液学参数及血红蛋白电泳结果发现，静止型α-地贫男、女患者MCV 和MCH 分别为男MCV：（78.40 ± 3.95）fl，女MCV：（78.83 ± 5.55）fl；男MCH：（25.96 ±1.47）pg，女MCH：（25.69 ± 2.18）pg，与上述结果［3］相似，且轻型及中间型α-地贫患者MCV、MCH 比静止型更低。另外，静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者MCV、MCH、MCHC、Hb、HCT 和HbA2均低于非地贫男性、女性（均P＜0.05），且MCV、MCH、MCHC、Hb 和HCT 都存在以下规律：静止型＞轻型＞中间型，说明α 基因突变或缺失的数量越多，α-地贫患者血液学指标结果异常的程度越大；而RBC 均高于非地贫男性、女性（均P＜0.05），在静止型、轻型及中间型α-地贫男、女患者中有逐渐升高的趋势，说明α-地贫患者RBC 增高的机制可能是由于存在慢性MCH 降低而出现的代偿现象，这与VELASCO-RODRIGUEZ 等［4］研究结果相似。在实验室检查中，MCV ＜80 fl 通常用于地贫的初步筛查，尽管该截断值几乎能筛查出所有α0地贫携带者，但约有75%的α+地贫携带者不能被检出［5］。另外大多数轻型地贫携带者的血液学指标和血红蛋白电泳结果通常表现正常，此时α-地贫的漏检率极高，因此为了进一步明确诊断α-地贫，以便更全面了解该病的临床表型，有必要对α 基因进行分子诊断。

表2 3 种α-地中海贫血表型血液学参数及血红蛋白电泳结果Tab.2 The results of hemoglobin electrophoresis and hematologic parameters in three phenotypes of alpha-thalassemia.Data present mean ± SD（standard deviation） ±s

表2 3 种α-地中海贫血表型血液学参数及血红蛋白电泳结果Tab.2 The results of hemoglobin electrophoresis and hematologic parameters in three phenotypes of alpha-thalassemia.Data present mean ± SD（standard deviation） ±s

项目MCV（fl）MCH（pg）MCHC（g∕L）Hb（g∕L）RBC（х1012∕L）HCT HbA2（%）HbF（%）静止型男性78.40±3.95 25.96±1.47 331.19±8.27 149.52±9.94 5.77±0.41 45.14±2.67 2.42±0.36 0.64±0.45女性78.83±5.55 25.69±2.18 325.56±8.98 126.94±11.11 4.95±0.37 38.96±2.93 2.19±0.53 0.62±0.42轻型男性65.65±4.05 21.32±1.31 324.81±8.00 139.08±8.08 6.55±0.51 42.82±2.32 2.34±0.33 0.71±0.53女性64.70±4.13 20.85±1.45 322.22±7.20 118.58±8.21 5.70±0.41 36.79±2.25 2.36±0.22 0.69±0.47中间型男性60.43±11.59 18.21±3.39 303.43±24.26 119.71±22.72 6.61±0.93 39.39±5.96 1.41±0.57 0.66±0.26女性61.42±9.95 19.28±2.91 314.75±15.80 104.44±17.52 5.45±0.75 33.09±4.80 1.47±0.69 0.66±0.26非地贫人群男性87.37±4.10 29.62±1.52 339.11±8.60 155.23±9.69 5.25±0.38 45.77±2.56 2.67±0.24 0.51±0.30女性86.87±3.67 28.91±1.41 332.81±7.74 132.87±8.41 4.60±0.34 39.92±2.29 2.58±0.29 0.59±0.33

HbH 病（中间型α-地贫）是一种严重而非致命的α-地贫类型，临床特征为明显的小细胞低色素溶血性贫血，可能机制是3 个α 基因缺失或缺陷，只能合成少量的α 链，引起β 链相对增多，形成HbH（β 四聚体，β4），而HbH 是一种不稳定血红蛋白，易被氧化使β4 解离成游离的单链，沉积在红细胞内后形成包涵体，造成红细胞膜僵硬易受损而被脾脏破坏吞噬。HbH 病患者通常表现为小细胞低色素性慢性溶血性贫血，但在氧化型药物、感染、脾肿大或轻度黄疸等因素刺激下可导致急性溶血发作［6］。一般来说，临床上α-地贫患者的严重程度与α 链缺陷的程度存在很大关联，非缺失型α+地贫可能比缺失型α+地贫合成更少的α 链，所以这可能是非缺失型α+与α0复合杂合子的HbH病患者通常比缺失型α+与α0复合杂合子HbH 病患者更严重的原因［7］。本研究不孕不育人群中HbH 病的检出率为0.229%（23∕10 020），低于HE等［8］报道广西百色市HbH 病的检出率（0.928%），造成两者差异较大的原因可能是该研究所选取对象的年龄范围较大（1～45 岁），空间跨度较小；而本研究之对象绝大多数来自广西各市县及镇，还有少数来自外省，空间跨度大，年龄段集中且仅限定为人群中的一小部分（不孕不育者）。但HbH 病的基因型都是以--SEA∕-α3.7为主。

Hb Bart's 胎儿水肿综合征（重型α-地贫）属于α-地贫最严重的类型，是α0地贫的纯合子状态，4个α 基因缺失致使完全无α 链合成，胎儿期即可发生大量γ 链聚合形成四聚体γ4（Hb Bart's），该物质对O2具有很高的亲合力，极易造成胎儿严重缺氧，因此胎儿在妊娠晚期可于宫内窒息或出生后不久死亡。当夫妻双方都是α0地贫携带者时，他们将有25%的机会怀上Hb Bart's 胎儿水肿综合征的后代，而且此类妊娠女性属于高风险人群，将面临出现严重并发症［1］，比如由于胎盘过大或心理负担过重造成先兆子痫、难产和产后大出血等。一项回顾性研究［1］显示，广西壮族自治区Hb Bart's 胎儿水肿综合征病例的α-地贫基因型绝大多数基因型为--SEA∕--SEA，极少数为--SEA∕--THAI，病例数呈逐年上升趋势，可能原因有：由于人口健康宣传教育，群众追求健康质量的意识观念已明显增强；专门针对地贫进行系统培训学习的专业医学人才不断增加；地贫筛查已包括在婚前及产前体检中；当地政府已为广西当地居民进行地贫和产前诊断成立了专项基金等。本研究结果显示不孕不育人群共检出α-地贫基因型19 种，总携带率为6.23%（624∕10 020），而马升俊等［9］在广西南宁地区研究中共检出了15 种α-地贫基因型，总携带率略高（8.54%）。本研究除了基因型αWSα∕αα 在女性中占较大比例外，其余基因型在男性与女性之间所占比例相差不大，α0地贫个体占3.02%（303∕10020），其中最常见的基因型为--SEA∕αα，与外省报道的结果相似［10-13］。

由于饮食方式、生活方式、心理压力以及外界环境等因素的综合影响，广西不孕不育患者成为了一个特殊的群体，近年来该群体的数量呈日渐增长趋势，加之α-地贫在广西地区具有很高的患病率，α0地贫携带率也较高，若与α+或α0携带者结合有产下HbH 病或Hb Bart's 胎儿水肿综合征后代的风险，将给政府、家庭以及小孩造成严重的健康与经济负担。因此本研究为提高广西不孕不育人群α-地贫患者进行IVF-ET 前和孕期保健质量提供了一些依据或数据支持，通过筛查、基因诊断、遗传咨询、产前诊断等多种手段综合应用可科学有效预防及避免α-地贫患儿（尤其是Hb Bart's 患儿）的出生，从而达到科学指导优生优育。