高效液相色谱法测定五氯柳胺混悬液的含量及有关物质

白玉彬，张吉丽，朱建民，苏文杰，董 朕，周绪正，张继瑜，*

(1.中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050； 2.常州齐晖药业有限公司，江苏 常州 213000)

五氯柳胺(oxyclozanide)是水杨苯酰胺类药物，化学名为2，3，5，-三氯-N-(3，5-二氯-2-羟基苯基)-6-羟基苯甲酰胺，其作用机理主要是抑制寄生虫体内的氧化磷酸化过程，阻止ATP的产生，从而导致虫体死亡[1-3]，主要用于治疗肝片吸虫，同时对绦虫和线虫也具有良好的治疗效果[4-9]。2013版英国药典[10]和2010版印度药典[11]均采用吸光度法测定五氯柳胺混悬液的含量，采用TLC法检查五氯柳胺混悬液有关物质，我国还没有有关五氯柳胺检测方法的相关报道。吸光度法和TLC法的灵敏度、分离度和准确度等均较低，为严格有效地控制药品的质量，笔者通过参考相关文献[12-19]，采用HPLC方法，建立了HPLC法测定五氯柳胺混悬液含量及有关物质的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

五氯柳胺标准品(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)，3，5，6-三氯水杨酸(英国药典委员会)，2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐(英国药典委员会)，磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)，五氯柳胺混悬液(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所自制)。

1.1.2 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 含量测定

HPLC条件。色谱柱Hypersil BDS C18(150×4.6 mm，5 μm)；流动相0.1%磷酸水-甲醇(体积比38∶62)；流速为2.0 mL·min-1；检测波长300 nm；进样量20 μL；柱温25 ℃。取本品适量(约相当于五氯柳胺68 mg)，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分混匀，离心，精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

专属性试验。五氯柳胺对照品溶液：精密称定五氯柳胺对照品6.8 mg，置100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解后，再用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。五氯柳胺供试品溶液：取本品适量(约相当于五氯柳胺68 mg)，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分混匀，离心，精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。辅料干扰溶液：不加五氯柳胺的空白混悬液样品，按供试品溶液配制方法进行配制。3，5，6-三氯水杨酸溶液：精密称取3，5，6-三氯水杨酸对照品10.2 mg于20 mL容量瓶中，用2 mL四氢呋喃溶解后，用流动相稀释至刻度，摇匀，得501 μg·mL-1的3，5，6-三氯水杨酸溶液。再准确移取1 mL该溶液于50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得。2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液：精密称取2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐对照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用流动相溶解并稀释至刻度(必要时可超声溶解)，摇匀，得501 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液。再准确移取1 mL该溶液于50 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得。专属性溶液：精密称取6.8 mg五氯柳胺对照品至100 mL容量瓶，用20 mL甲醇溶解后，再分别加入501 μg·mL-1的3，5，6-三氯水杨酸溶液和501 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液各2 mL，用流动相定容，摇匀，即得。分别将溶剂、辅料干扰溶液、五氯柳胺对照品溶液、五氯柳胺供试品溶液、3，5，6-三氯水杨酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐和专属性溶液照色谱条件进行测定，记录色谱图。

标准曲线。精密称取五氯柳胺适量于100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解样品后，再用流动相定容，摇匀，配制成104.35 μg·mL-1的五氯柳胺标准品母液，再将其依次稀释为85.01、68.01、52.18、34.01 μg·mL-1的标准品溶液，分别取20 μL进样，记录色谱图。以五氯柳胺标准品的峰面积y为纵坐标，以五氯柳胺标准品的浓度c为横坐标，绘制峰面积(y)-质量浓度(c)标准曲线。

进样精密度。照专属性试验中对照品溶液配制方法，配制五氯柳胺对照品溶液，照色谱条件连续进样6针，记录色谱峰面积，计算峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。RSD不得大于2.0%。

中间精密度。分别由2个不同的操作人员使用不同的仪器进行测定。取同一批均匀样品按照供试品溶液配制方法，配制6份供试品溶液，各取20 μL注入高效液相色谱中，照色谱条件测定。记录色谱峰面积，分别计算RSD。

准确度。精密称取五氯柳胺标准品适量，置于容量瓶中，加入处方量空白辅料，按照对照品溶液配制方法，分别配制成浓度为34、68、104 μg·mL-1的五氯柳胺对照品溶液，每个浓度各3份，按照色谱条件，精密量取20 μL进样，记录峰面积，测定每个样品的实际浓度，计算各样品的回收率、平均回收率及RSD。

溶液稳定性。按照供试品溶液配制方法，配制五氯柳胺供试品溶液，分别在0 h和30 h，取20 μL注入液相色谱中，按照色谱条件测定，记录色谱图，以五氯柳胺峰面积计算RSD。

耐用性试验。按照专属性试验下对照品溶液及供试品溶液配制方法，分别制备对照品溶液及供试品溶液，分别考察流速变化 ± 0.2 mL·min-1、柱温变化 ± 5 ℃、流动相比例变化 ± 2%，以及选用同一品牌不同批号和填料或规格类似的不同品牌色谱柱时仪器的色谱行为变化情况，观察基线分离情况，计算各条件下所测数据的平均值及RSD。

样品含量的测定。取本品适量(约相当于五氯柳胺68 mg)，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分混匀，离心；精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样20 μL，记录峰面积，带入线性回归方程，求出检测的五氯柳胺混悬液样品的质量浓度。

1.2.2 有关物质测定方法

HPLC条件。色谱柱为InertSustainSwift C18(150×4.0 mm，5 μm)；以0.1%磷酸水溶液-甲醇(体积比38∶62)为流动相，流速为1.5 mL·min-1；检测波长为300 nm，进样量为20 μL，柱温为25 ℃。

有关物质测定方法。取本品适量(约相当于五氯柳胺102 mg)，精密称定，置100 mL容量瓶中，加20 mL甲醇超声溶解并充分混匀，用流动相稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取对照溶液和供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，单个杂质不得超过0.5%，杂质总量不得超过1.0%，供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.05倍的色谱峰忽略不计。

专属性试验。3，5，6-三氯水杨酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液配制方法同1.2.1节专属性试验方法。专属性溶液：精密称量五氯柳胺对照品51 mg至50 mL容量瓶，用10 mL甲醇溶解后，再加入上述3，5，6-三氯水杨酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸溶液各1 mL，用流动相定容，摇匀，即得。空白辅料溶液：取不含五氯柳胺的空白辅料适量(约2 mL)，精密称定，于100 mL容量瓶中用20 mL甲醇溶解，充分混匀后，再用流动相稀释至刻度，摇匀。离心后取上清液进样。供试品溶液：取本品适量(约相当于五氯柳胺102 mg)，精密称定，于100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解，并充分混匀后，再用流动相稀释至刻度，摇匀。离心后取上清液进样。按色谱条件，精密量取20 μL的3，5，6-三氯水杨酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐、专属性溶液、空白辅料溶液、供试品溶液进样，记录色谱图。空白辅料溶液峰、3，5，6-三氯水杨酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐峰分离度均大于1.5，不干扰主峰测定，表明该方法专属性好。记录色谱图。

标准曲线绘制。3，5，6-三氯水杨酸溶液配制：精密量取3，5，6-三氯水杨酸对照品10.2 mg于20 mL容量瓶中，用2 mL四氢呋喃溶解，并用流动相稀释至刻度，配制成510 μg·mL-1的3，5，6-三氯水杨酸对照品溶液。2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液配制：精密称取2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐对照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用流动相溶解并稀释至刻度(必要时可超声溶解)，摇匀，配制成约510 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液。五氯柳胺对照品溶液：精密称取五氯柳胺对照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用4 mL甲醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，配制成510 μg·mL-1的五氯柳胺对照品溶液。分别准确移取510 μg·mL-1的3，5，6-三氯水杨酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐溶液和五氯柳胺对照品溶液各5 mL于25 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，配制成含102 μg·mL-1浓度的各杂质溶液；将其依次稀释，配制成约含各杂质浓度为20.40、10.20、5.10、2.04、0.51 μg·mL-1的杂质混合溶液。分别取20 μL进样，记录色谱图，以标准品的峰面积y为纵坐标，以标准品的浓度c为横坐标，绘制峰面积(y)-质量浓度(c)标准曲线。

进样精密度。取线性测试项下的0.51 μg·mL-1的杂质混合溶液，照色谱条件连续进6针，记录色谱峰面积，计算RSD。计算峰面积RSD。

中间精密度。取同一批均匀样品，按照供试品溶液配制方法配制6份供试品溶液，由一名试验员按方法规定分别测定上述6个样品。由另一名试验员按方法规定，在不同一天选择不同的仪器，另外分别配制和测定6个样品。记录色谱图，计算RSD。

定量限和检测限。配制2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐、3，5，6-三氯水杨酸和五氯柳胺的标准溶液，并将其依次稀释，进样分析，计算信噪比，当信噪比为3时，该浓度为检测限，信噪比为10时，该浓度为定量限。

准确度。精密称定五氯柳胺混悬液适量(约相当于含五氯柳胺51 mg)于50 mL容量瓶中，并加入处方辅料，加入10 mL甲醇溶解，加入适量2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐和3，5，6-三氯水杨酸，配制成含各杂质浓度约为0.35、5.8、20.4 μg·mL-1的杂质混合溶液各3份，精密量取20 μL，进样，计算回收率。

溶液稳定性：按照对照溶液及供试品溶液配制方法，分别配制对照溶液及供试品溶液，分别测定新配制样品及在样品箱中放置48 h后的样品溶液。

耐用性试验：照专属性试验中专属性溶液、供试品溶液及对照溶液配制方法，配制专属性溶液、供试品溶液及对照溶液，分别考察流速改变±0.2 mL·min-1、柱温改变±5℃、流动相比例改变± 2%以及选用不同批号或不同厂家色谱柱的仪器色谱行为变化，观察基线分离情况，计算各条件下所得数据的平均值及RSD。

有关物质检查：照有关物质测定方法项下方法，分别配制供试品溶液和对照溶液，分别取20 μL进样。供试品溶液记录的色谱图中，如有杂质峰(不包括溶剂峰)，单个杂质不得超过0.5%，总杂质含量不得超过1.0%。

2 结果与分析

2.1 含量测定结果

2.1.1 专属性试验

辅料干扰峰及杂质3，5，6-三氯水杨酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐产生的峰与主峰完全分离，分离度均大于1.5，证明该方法专属性好。

2.1.2 标准曲线

以五氯柳胺标准品的峰面积y为纵坐标，以五氯柳胺标准品的浓度c为横坐标，绘制峰面积(y)-质量浓度(c)标准曲线，求得标准曲线的回归方程为y=237288.952c+18980.896，决定系数R2=1.000，表明该方法可用于五氯柳胺混悬液含量测定。

2.1.3 进样精密度

连续进6针五氯柳胺对照品溶液，其峰面积分别为1 6154 972、16 145 538、16 157 408、16 159 043、16 173 572、16 183 977，RSD为0.1%，小于2.0%，表明本方法的进样精密度良好。

2.1.4 中间精密度

由表1结果可知，第1人测得含量RSD为0.36%，第2人测定含量RSD为0.11%，平均RSD为0.23%，均小于2.0%，表明该方法中间精密度好。

2.1.5 准确度

由表2结果可知，3个浓度下的回收率分别为100.43%、99.97%、99.97%，平均回收率为100.12%，回收率RSD<2%，证明该方法回收率好。

2.1.6 溶液稳定性

供试品溶液在室温下放置30 h后，其峰面积未发生明显变化，峰面积RSD=0.1%，小于2.0%，表明本样品在室温下放置30 h稳定。

表1中间精密度试验结果

Table1Results of intermediate precision

人员Personnel重复Repeats含量Content/%平均含量Average content/%RSD/%甲1106.6106.220.36A2106.63105.94105.85106.56105.9乙1107.3107.500.11B2107.53107.54107.65107.56107.6

2.1.7 耐用性试验

由表3结果可知，主峰与杂质峰均达到基线分离，在流速改变 ± 0.2 mL·min-1、柱温改变±5℃、流动相比例改变±2%，以及选用不同批号或不同厂家色谱柱条件下所测主成分标示含量的RSD均小于2.0%，说明流动相比例、柱温及流速等条件的微小变化对含量测定结果无显著影响，表明该方法耐用性好。

2.1.8 样品含量

参照含量测定方法，测定3批中试样品的含量，3批中试样品含量分别为100.9%、101.1%、101.0%，均在标示量范围(95%～105%)内。

2.2 五氯柳胺混悬液有关物质测定结果

2.2.1 专属性试验

空白辅料溶液峰、杂质3，5，6-三氯水杨酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐峰与主峰分离度均大于1.5，不干扰主峰测定，表明该方法专属性好。

2.2.2 标准曲线

表2回收率实验结果

Table2Results of recovery

理论浓度Theoretical concentration/(μg·mL-1)重复Repeats实际浓度Actual concentration/(μg·mL-1)回收率Recovery/%平均回收率Average recovery/%RSD/%34134.18190100.5100.430.06234.12455100.4334.13033100.468168.00144100.099.970.06267.9616999.9368.01171100.01041104.2706299.999.970.062104.32736100.03104.36308100.0

表3含量测定耐用性实验结果

Table3Durability results of content determination

变化项Change items主峰及各杂质峰基线分离Separation of the main peakfrom the adjacent peak含量Content/%平均含量Averagecontent/%RSD/%柱温-5 ℃ Column temperature-5 ℃是Yes104.8105.20.83柱温不变 Column temperature unchanged是Yes106.2柱温+5 ℃ Column temperature+5 ℃是Yes104.6流动相比例-2% Proportion of mobile phase-2%是Yes105.1105.50.58流动相比例不变 proportion of mobile phase unchanged是Yes106.2流动相比例+2% Proportion of mobile phase+2%是Yes105.2流速-10% Flow rate-10%是Yes104.6105.30.78流速不变 Flow rate unchanged是Yes106.2流速+10% Flow rate+10%是Yes105.1色谱柱1 Column 1是Yes100.5100.70.17色谱柱不变 Column unchanged是Yes100.5色谱柱2 Column 2是Yes100.8色谱柱3 Column 3是Yes100.8

2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐标准曲线线性回归方程为y=130721.123c+36630.203，其相关系数为0.996；3，5，6-三氯水杨酸标准曲线线性回归方程为y=123451.705c+2478.855，其相关系数为1.000；五氯柳胺标准曲线线性回归方程为y=318112.192c-11199.561，其相关系数为1.000，线性关系良好。表明以上标准曲线可用于五氯柳胺混悬液有关物质的测定。

2.2.3 进样精密度

由表4可知，连续进6针杂质混合溶液，已知杂质2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐峰面积RSD为3.73%，3，5，6-三氯水杨酸峰面积RSD为0.24%，五氯柳胺峰面积RSD为0.17%，均小于2.0%，表明本方法的进样精密度良好。

2.2.4 中间精密度

由表5可知，已知杂质2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐和3，5，6-三氯水杨酸在供试品溶液中未检出，2个人员测得的总杂质RSD均为0，平均RSD为0，表明该方法中间精密度好。

2.2.5 定量限和检测限

表4进样精密度

Table4Results of injection precision

样品名Sample names浓度Content/(μg·mL-1)重复Repeats峰面积Peak area平均峰面积Average areaRSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚盐酸盐5.078017171886925653.732-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride269337036942414718508568403366480523,5,6-三氯水杨酸4.984016176776172140.243,5,6-trichlorosalicylic acid26166583615636461975856159646617588五氯柳胺5.04791159025015854630.17Oxyclozanide2158584331583286415861455158322661584028

表5中间精密度

Table5Results of intermediate precision

人员Personel重复Repeats杂质含量Impurity content/%2-氨基-4,6-二氯苯酚盐酸盐2-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride3,5,6-三氯水杨酸3,5,6-trichlorosalicylic acid总杂质Total impurityRSD/%甲1<0.05<0.050.320A2<0.05<0.050.323<0.05<0.050.324<0.05<0.050.325<0.05<0.050.326<0.05<0.050.32乙1<0.05<0.050.300B2<0.05<0.050.303<0.05<0.050.304<0.05<0.050.305<0.05<0.050.306<0.05<0.050.30

试验结果表明：2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐定量限为0.064 8 μg·mL-1，检测限为0.019 6 μg·mL-1；3，5，6-三氯水杨酸定量限为0.097 9 μg·mL-1，检测限为0.029 7 μg·mL-1；五氯柳胺溶液定量限为0.141 8 μg·mL-1，检测限为0.043 9 μg·mL-1。

2.2.6 准确度

由表6可知，2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐平均回收率为110.3%，RSD均小于1%；3，5，6-三氯水杨酸平均回收率为98.6%，RSD均小于2%。证明该方法准确度好。

2.2.7 溶液稳定性

稳定性试验结果表明，已知杂质2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐、3，5，6-三氯水杨酸未检出，未知杂质1及未知杂质2放置48 h后含量未发生变化，杂质1含量均为0.15%；杂质2含量均为0.17%，总杂质含量为0.3%。表明样品在室温下放置48 h稳定。

2.2.8 耐用性

从专属性溶液和样品溶液耐用性测定结果(表7、表8)可以看出，随着流动相、流速、柱温以及色谱柱的变化，色谱峰分离度均>1.5，理论塔

表62-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐和3，5，6-三氯水杨酸回收率

Table6Recovery of 2-amino-4， 6-dichlorophenol hydrochloride and 3，5，6-trichlorosalicylic acid

杂质名称Impurity names理论浓度Theoreticalconcentration/(μg·mL-1)实际浓度Actual concentration/(μg·mL-1)回收率Recovery/%RSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚盐酸盐0.35100.35218100.30.72-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride0.35399100.80.35706101.75.09855.77210113.20.65.83414114.45.78723113.520.394023.82707116.80.323.73363116.423.69940116.23,5,6-三氯水杨酸0.51070.4750993.01.13,5,6-trichlorosalicylic acid0.4837294.70.4749293.05.10705.15447100.90.55.19728101.85.14725100.820.428020.69724101.30.320.60344100.920.58160100.8

表7专属性溶液耐用性测定结果

Table7Durability of specific solution

样品名Sample name变化项Change items保留时间Remain time/min理论塔板数Theoretical plate number分离度Resolution2-氨基-4,6-二氯苯酚盐酸盐正常条件Normal condition1.9834205—2-amino-4,6-dichlorophenol流动相比例+2% Proportion of mobile phase+2%2.0674446—hydrochloride流动相比例-2% Proportion of mobile phase-2%1.8174148—流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-12.2474782—流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-11.7073894—柱温+5 ℃ Column temperature+5 ℃1.8674267—柱温-5 ℃ Column temperature-5 ℃2.0004214—色谱柱1 Column 11.8032433—色谱柱2 Column 21.82728196.7色谱柱3 Column 33.1003438—色谱柱4 Column 41.8133450—

续表7

“—”表示未测得数据。

“ —” represent no data was measured.

表8样品溶液耐用性试验结果

Table8Durability test of Sample solution

样品名Sample names变化项Change items杂质含量/%Content ofimpurity/%杂质平均含量Averagecontent/%RSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚盐酸盐正常条件 Normal condition<0.052-amino-4,6-dichlorophenol柱温-5 ℃ Column temperature-5 ℃<0.05<0.05N/Ahydrochloride柱温+5 ℃ Column temperature+5 ℃<0.05流动相比例-2% Proportion of mobile phase-0.2%<0.05<0.05N/A流动相比例+2% Proportion of mobile phase+0.2%<0.05流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-1<0.05<0.05N/A流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-1<0.05色谱柱1 Column 1<0.05<0.05N/A色谱柱2 Column 2<0.05色谱柱3 Column 3<0.053,5,6-三氯水杨酸正常条件 Normal condition<0.053,5,6-trichlorosalicylic acid柱温-5 ℃ Column temperature-5 ℃<0.05<0.05N/A柱温+5 ℃ Column temperature+5 ℃<0.05流动相比例-2% The proportion of mobile phase-0.2%<0.05<0.05N/A流动相比例+2% The proportion of mobile phase+0.2%<0.05流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-1<0.05<0.05N/A流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-1<0.05色谱柱1 Column 1<0.05<0.05N/A色谱柱2 Column 2<0.05色谱柱3 Column 3<0.05

续表8

N/A代表不适用。

N/A represent not applicable.

板数均>2 400，已知杂质能够完全分离。流速改变±0.2 mL·min-1、柱温改变±5 ℃、流动相比例改变±2%及选用不同批号或不同厂家色谱柱，已知杂质2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐、3，5，6-三氯水杨酸在样品中未能检测出，总杂质含量均小于1%，RSD均小于10%。试验结果表明，流动相比例、柱温、流速以及色谱柱等条件改变对有关物质的测定结果无明显影响，说明该方法耐用性良好。

2.2.9 有关物质

照有关物质测定方法，测定3批中试样品的有关物质，结果表明，3批中试样品中2个未知杂质含量均小于0.5%，总杂质含量均小于1%(表9)。

表9有关物质测定结果

Table9he results of impurity determination %

3 讨论

2013版英国药典中采用紫外分光光度法测定五氯柳胺混悬液的含量，采用TLC法测定五氯柳胺混悬液有关物质含量，以点浓度深浅来判断已知杂质2-氨基-4，6-二氯苯酚盐酸盐、3，5，6-三氯水杨酸的浓度是否超过限度。上述2种方法灵敏度、准确度和分离度均较差，且TLC方法不能准确定量检测，影响实验结果的测定。HPLC方法灵敏度高、准确度好，能够准确定量检测，参考相关文献，本研究建立了用于测定五氯柳胺混悬液含量及有关物质的HPLC方法。

为了确定五氯柳胺混悬液的最大吸收波长，按照对照品溶液及供试品溶液方法，配制对照品溶液及供试品溶液，采用DAD检测器进行全波长扫描，确定五氯柳胺的最大吸收波长为300 nm，这一结果与英国药典结果一致，所以选择300 nm作为检测波长。对于流动相的考察，首先分别选用乙腈-水及甲醇-水作为流动相，发现五氯柳胺峰形较差，为了解决这一问题，向水相中加入0.1%的磷酸，以调整峰形。发现以0.1%磷酸-甲醇溶液作为流动相时峰形优于0.1%磷酸-乙腈溶液。

动物寄生虫病是动物常发且造成巨大损失的传染病，肝片吸虫作为一种常见人畜共患病原体，长期危害人类及动物的健康，药物防治是肝片吸虫病防控的关键。五氯柳胺作为化学合成类抗肝片吸虫药物，具有性质稳定、疗效显著等优点，是新型、高效、安全的抗肝片吸虫药物，且该药具备无污染、低残留等良好的理化性质，与其他具有相似作用的三氯苯达唑、氯苯碘柳胺、阿苯达唑等药物相比，五氯柳胺至今未出现耐药性的相关报道[20-21]，并凭借其显著的治疗效果在国外得到广泛使用，是临床抗蠕虫感染的首选。至今为止，国内对五氯柳胺的研究停留在原料药方面，尚未有五氯柳胺相关制剂的报道[22-24]。针对目前严重危害我国动物养殖业和公共卫生安全的动物寄生虫疾病，开发国内新型动物专用抗寄生虫病药物五氯柳胺及其制剂，对解决目前我国所使用的抗寄生虫药物存在的耐药性、副反应大和治疗效果不确实等问题具有重大的意义。建立完善的五氯柳胺混悬液含量及有关物质检测方法，为控制产品质量提供有效的分析手段及理论依据，对产品的安全使用具有重要意义。