油用牡丹种质资源及育种研究进展

陈法志，陈 镇，戢小梅，李秀丽，陈志伟，翟敬华

（武汉市农业科学院 林业果树研究所；湖北省木本功能植物利用工程技术研究中心，湖北 武汉 430075）

牡丹（Paeonia suffruticosa）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（SectionMoutan DC.）多年生落叶小灌木［1］，是我国特有的名贵花卉和药用植物。我国是牡丹组植物的起源、分布和演化中心，有9 个种，主要分布于我国秦岭、大巴山一带，作为传统的药用和观赏植物，至今已有1 600 多年的栽培历史。油用牡丹是指结实能力强、能够生产种籽、加工食用牡丹籽油的牡丹［2］，其集食用、药用保健、观赏等多种价值于一体，是国家为保障粮油安全和优质食用油有效供给而大力发展的新兴木本油料之一。 油用牡丹是在传统药用牡丹和观赏牡丹基础上发展起来的，主栽类型有‘凤丹’（Poeonia ostiiT.Hong et J.X.Zhang）和紫斑牡丹（Poeonia rocktiiT.Hong et J.J.Li）。目前我国油用牡丹资源挖掘与利用处于起步阶段，严重滞后于产业发展，当前推广栽培的油用牡丹品种单一，缺乏优质高产的专用品种，这是制约我国油用牡丹产业健康持续发展的瓶颈之一。笔者通过查阅相关文献资料，总结油用牡丹种质资源、遗传育种等方面的研究进展，对未来发展趋势进行展望，以期为油用牡丹育种提供参考。

1 油用牡丹种质资源及分布

种质资源是油用牡丹育种和生产的物质基础和源头，对油用牡丹产业健康持续发展有决定性作用。我国是牡丹唯一原产地和分布中心，也是牡丹栽培及遗传多样性的中心［3］。牡丹种质资源包括野生原种资源和栽培资源，我国牡丹栽培经过长期多区域的栽培演化，已形成丰富多样的种质资源，这些种质资源是培育油用牡丹良种的基础材料和原始材料，对其收集保存、整理评价和挖掘利用对油用牡丹产业健康发展有重要意义。

1.1 野生牡丹资源

我国牡丹野生资源有9 个种，分别是大花黄牡丹（P.ludlowii）、黄牡丹（P.lutea）、狭叶牡丹（P.pota⁃ninii）、四川牡丹（P.decomposita）、紫斑牡丹（P.rockii）、矮牡丹（P.jishanensis）、杨山牡丹（P.ostii）、卵叶牡丹（P.qiui）、紫牡丹（P.delavayi）［4］。中国境内共有8 个省份（自治区）分布有牡丹组植物，分别为陕西、山西、河南、甘肃、四川、湖北、云南、西藏，其中陕西省牡丹资源最为丰富，有4 个种1 个亚种。紫斑牡丹分布范围最广，分布于陕西、甘肃、河南及湖北［5］。野生牡丹自然繁殖特性分为兼性营养繁殖和专性种子繁殖两种类型，紫牡丹、黄牡丹、狭叶牡丹、卵叶牡丹、矮牡丹以多种形式的营养繁殖为主，种子繁殖为辅，杨山牡丹、紫斑牡丹、大花黄牡丹、四川牡丹为专性种子繁殖［6］。9 个野生牡丹种结实性状较好的有杨山牡丹、紫斑牡丹、大花黄牡丹。大花黄牡丹为西藏特有种，成年植株可产生大量种子，且种子巨大，千粒重达1 332 g 左右，富含不饱和脂肪酸（86.32%），其油脂成分中单不饱和脂肪酸油酸含量高，多不饱和脂肪酸亚麻酸含量低，油脂的稳定性好［7］。9 个野生牡丹种籽出油率存在差异，出油率最高的是杨山牡丹（22.31%），最低的是紫牡丹（12.06%）和紫斑牡丹（12.04%），其他牡丹种籽的出油率在16.96% ～21.47%之间。亚麻酸含量最高的是狭叶牡丹（39.45%），最低的是四川牡丹（13.88%），其他牡丹种籽亚麻酸含量在22.30%～36.12%［8］。

1.2 牡丹栽培品种

我国牡丹栽培历史悠久、栽培地域广阔，牡丹在长期驯化栽培过程中形成不同品种群。根据野生原种、生态习性和栽培地区生态环境的不同，主要分为4 个品种群：中原牡丹品种群（P.suffruticosaZhongyuan Group），主要分布在黄河中下游流域和华北地区，以河南洛阳和山东菏泽为栽培中心，该品种群的主要原种为矮牡丹和紫斑牡丹，其栽培历史最悠久、品种类型最多、分布面积最广，属“温暖干燥生态型”；江南牡丹品种群（P.suffruticosaJiangnan Group），主要分布在长江中下游流域的安徽、浙江、江苏、湖北等地，以安徽宁国和铜陵、上海、南京为栽培中心，主要野生原种为杨山牡丹，现存品种30 多个，该品种群耐高温、高湿，适应长江以南高温、多湿、地下水位高的自然条件，属“高温高湿生态型”；西南牡丹品种群（P.suffruticosaXinan Group），主要分布在四川、云南、贵州、西藏等地，以四川彭州、贵州毕节、云南大理为栽培中心，该品种群适应温暖、湿润多雾的气候，属“山地温暖湿润型”；西北牡丹品种群（P.suffruticosaXibei Group），主要分布在甘肃、陕西、宁夏、青海等地，以兰州、榆中、临洮为栽培中心，主要栽培原种为紫斑牡丹，现存品种300 多个，该品种群耐寒耐旱、耐盐碱、病虫害少，属“高原冷凉干燥型”［9-10］。还有其他小型牡丹品种群如延安牡丹品种群（P.yananensisYan′an Group）和保康牡丹品种群（P.baokangensisBaokang Group）等。湖北恩施和襄阳、湖南邵阳、重庆垫江、安徽铜陵等地区是我国药用牡丹的传统产区，经过长期栽培演化形成了较丰富的地方牡丹资源，这些资源蕴藏着丰富的可利用基因。

1.3‘凤丹’牡丹品种群

油用牡丹是在药用牡丹和观赏牡丹基础上发展起来的，当前油用牡丹推广栽培的主要有‘凤丹’、紫斑牡丹两大系列。‘凤丹’系列是江南牡丹品种群的一个亚群，是由杨山牡丹长期栽培演化形成的观赏兼药用的品种群［11］，具有植株高大、根系浅、耐湿热、花量大、萌蘖少、结实率高、适应性强、病虫害少等特点，是江南地区培育耐湿热品种的重要种质资源［12］。‘凤丹’系列主要由药用牡丹逐步演化而成，从杨山牡丹演化到‘凤丹’系列是纯合向不同等级杂合的过程，主要有‘凤丹白’‘凤丹粉’‘凤丹紫’‘凤紫荷’‘凤白荷’‘凤粉荷’6 个品种，前3 个品种为单瓣型，花色有差异，后3 个品种为荷花型［13］。‘凤丹’是南方地区牡丹栽培的主要类型，不同地区栽培的‘凤丹’其结实性状存在差异，湖北保康、重庆垫江、湖南邵阳、安徽铜陵和亳州地区栽培的‘凤丹’结实性状调查表明，不同基因型单株果荚数为4 ～29 个，单株种子数量为22 ～940 粒，单株种子产量为3.5 ～233.8 g。不同地区种子含油率为23.54% ～31.46%，亚麻酸、亚油酸和油酸为其脂肪酸的主要成分，其中亚麻酸含量为43.36%～49.9%［14］。

2 油用牡丹分子育种研究

2.1 油用牡丹分子标记和遗传多样性

洛阳市农林科学院与华大基因农业控股有限公司合作，采用第三代测序技术完成了牡丹基因组精细图的绘制，基因组组装大小12.25 GB（约为人类基因组的4.5 倍），注释了65 898 个基因，获取了牡丹花色、花型控制基因及牡丹籽油合成相关的基因，构建了牡丹基因组及表型数据库，涵盖1 000 余份牡丹品种资源。冯玉兰等［15］对牡丹组9 个野生种15 个居群及‘凤丹’叶绿体psbA-trnH 和trnL-F 序列进行测序，构建了psbA-trnH 序列和trnL-F 序列系统发生树，两个序列的基因树均支持牡丹组划分为2 个亚组的分类方法，验证了杨山牡丹和‘凤丹’具有最近或较近的亲缘关系。‘凤丹’原始种杨山牡丹具有较高的遗传多样性，10 个居群杨山牡丹孢粉学标记表明，不同居群的花粉形态差别较大，同一居群内花粉形态也有差异；杨山牡丹AFLP 分子标记显示，在物种水平上，总的多态百分率（P）为93.23%，基因多样性指数（H）为0.337 6，香农指数（I）为0.502 5，80.09%的遗传多样性存在于居群内［16］。有学者以‘凤丹’为材料，开发SSR 分子标记，构建SSR-PCR 反应体系，筛选出12 条多态性引物，为油用牡丹遗传连锁图谱的构建和分子育种奠定了基础［17-18］。

2.2 油用牡丹功能基因的挖掘

油用牡丹分子生物学研究目前处于起步阶段，仅限于某个单一功能基因的克隆和基因功能的推测，缺乏对脂类代谢系统性和整体性的研究。油用牡丹种籽富含α-亚麻酸（ALA）和亚油酸（LA），二者均由油酸（OA）脱氢而来［19］。ALA 和LA 合成和积累的分子机制是油脂代谢的热点研究领域。研究表明凤丹种子发育分为3 个阶段（授粉后30、60、90 d），通过转录组测序、差异表达基因分析和qRT-PCR技术分析，基因FAD3可能与牡丹种子积累大量ALA 有关［20-21］。黄兴林等［22］采用RACE 和RT-PCR 技术克隆获得油用牡丹‘凤丹’脂肪酸脱氢酶基因FAD3全长cDNA 序列，其在‘凤丹’不同组织中存在多种表达模式，表明FAD3在‘凤丹’不饱和脂肪酸积累过程中发挥重要作用。宋淑香等［23］以‘凤丹’胚珠为材料，采用反转录PCR 和RACE 方法克隆获得脂肪酸去饱和酶基因FAD2的DNAc 全长，命名为Po FAD2，该基因属于脂肪酸去饱和酶家族，Po FAD2在‘凤丹’不同组织中表达差异大。油体（Oil body）是油料作物种子储藏脂肪的细胞器，油体膜蛋白是构成油体的重要部分，对维持油体大小和稳定起到重要作用［24-25］。李志远等［26］克隆出‘凤丹’种子油体膜蛋白基因（OLE）PoOLE17.5，生物信息学分析显示，该基因编码蛋白包括2 个亲水性区域和1 个疏水性区域，并具有1 个保守结构域“Oleo⁃sin domain”，PoOLE17.5在‘凤丹’种子发育过程中的表达水平逐渐上升，在种子成熟时表达水平最高，而后略有下降。油用牡丹成熟种子有一层黑色的种皮，影响了牡丹籽油的加工和品质。魏新翠［27］对‘凤丹’籽种皮的黑色素成分进行了鉴定，并对其合成基因进行克隆和表达分析，检测表明牡丹籽种皮显黑色的主要色素为矢车菊素——半乳糖苷和阿拉伯糖苷，克隆出合成矢车菊素——半乳糖苷和阿拉伯糖苷的关键酶基因ANS（花色素合成酶基因，Anthocyanidin），基因全长1 065 bp，共编码354 个氨基酸，ANS基因在‘凤丹’开花过程中呈先下降后上升又下降的趋势，其中盛花期表达量最高，末花期表达量最低，其表达量与花色深浅相对应，间接验证了ANS基因对种皮颜色的调控，成功构建了油用牡丹基因重组载体T-mANS，为后续的原核表达奠定了基础［27］。李果［28］以‘凤丹’籽种皮和种仁为材料，克隆出二氢黄酮醇4-还原酶基因DFR，该基因含有1 个长度为1 092 bp 的阅读框（ORF），共编码364 个氨基酸，该基因在‘凤丹’种子发育时期表达量先上升后下降，构建了原核表达载体，获得PoDFR 原核表达蛋白，通过与反应底物二氢槲皮素反应，证明PoDFR 蛋白能够催化合成无色花青素物质，并且与ANS 蛋白结合反应能合成花青素类物质。采用高通量测序技术对‘凤丹’籽种皮和种仁进行转录组测序，通过KEGG 富集，获得8 个与‘凤丹’种皮木质素合成途径相关的基因。

3 油用牡丹传统育种

近几年来，科研工作者开展了油用牡丹的筛选和育种工作，取得了一定进展，但尚未有突破性的品种育成，目前采用的育种技术以人工系统选择和利用自然变异为主，也有‘凤丹’的辐射诱变育种［16，29］和化学诱变育种［16］的报道。实生选种是木本油料良种选育的重要途径之一，‘凤丹’个体间差异显著，变异丰富，选择范围较大，生长、结实性状差异大，产量性状之间存在相关性，可通过优良单株（株系）选择，培育丰产品种［30-32］。周家旺等［33］从保康紫斑牡丹中初步筛选出结籽量大、含油率高的优良单株9 个。西北农林科技大学从‘凤丹’群体中选育出我国首个油用牡丹新品种——祥丰，该品种6年生亩产种籽203 kg，8年生亩产310 kg，平均亩产较常规‘凤丹’提高28%，出油率提高33%。

我国牡丹种质资源丰富，利用现有的观赏牡丹和药用牡丹资源，筛选适合油用的品种是油用牡丹育种的重要途径。洛阳市农林科学院对西北地区和中原地区牡丹品种进行筛选时，发现‘玉盘珍’‘紫斑白’‘白菊’‘香玉’4 个品种在成花率、结实率和百粒重等园艺性状以及不饱和脂肪酸等方面均有较好的表现，‘景泰蓝’‘银红飞荷’2 个品种单产高于‘凤丹’，是培育油用牡丹新品种的优良材料［34-35］。杂交育种是培育油用牡丹新品种的主要方法，‘凤丹’属异花授粉植物，有微弱的自交结实性，不存在无融合生殖现象，育性强，亲和性高，与中原牡丹品种群、江南牡丹品种群和日本牡丹品种等均有较高的杂交亲和性，花粉直感效应明显，结实率高，是育种潜力巨大的优良牡丹品种资源［36-38］。戚杰等［39］开展不同种源的‘凤丹’种源内、种源间及与观赏牡丹品种间的杂交，结果显示人工授粉可明显提高种子数量，不同种源的‘凤丹’与7 个中原牡丹品种和3 个日本牡丹品种杂交，其中洛阳‘凤丹’与日本品种‘太阳’杂交单株种子产量最高。辐射育种和化学诱变育种是培育植物新品种的重要方法。高静［40］采用化学诱变法诱导‘凤丹’多倍体，以秋水仙素为诱变剂、二甲基亚砜为渗透剂处理‘凤丹’种子、混合芽和胚，其中混合芽诱变效果的最佳处理是秋水仙素浓度0.2%、二甲基亚砜浓度为1%、处理时间3 d，诱变率达到30%以上。

4 油用牡丹育种趋势与展望

油用牡丹产业要健康持续发展，选育综合性状优良的品种是基础和关键。我国牡丹种质资源十分丰富，但目前推广应用于油用牡丹栽培的种类单一，既难以满足产业快速发展对高产、高油脂含量良种的需求，也难以满足不同产区对良种丰富多样的需求，这是制约我国油用牡丹产业健康持续发展的瓶颈之一。因此，必须充分利用我国丰富的牡丹资源，在对不同种类种质资源系统收集的基础上进行综合评价，制订油用牡丹育种目标，采用现代分子育种技术、基因工程结合传统的育种技术，通过对目标性状的不断改良，选育适合不同区域栽培的油用牡丹种类，培育高产、稳产、高含油率、抗性强的优良品种，满足产业发展需求。