大黄酸抑制气道平滑肌收缩机制研究

张雯婧，于孟飞，刘贝贝，刘庆华

（中南民族大学 生命科学学院；武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北 武汉 430074）

哮喘是一种以慢性气道炎症和可变重塑为特征的呼吸系统疾病，影响全球3 亿多患者［1］，给政府、基础医疗部门、家庭、患者和护理人员带来了巨大的负担［2］。哮喘的症状包括喘息、呼吸短促、胸闷和咳嗽，其主要原因是气道高反应（airway hyper-responsiveness，AHR）。气道高反应是指非特异性刺激在正常人呈无反应状态或反应程度较轻，而在某些人却引起了明显的支气管狭窄，其机制尚不明确［3］。目前治疗气道高反应的药物主要是β2受体激动剂，这类药物具有严重的不良反应，如心悸、震颤、头痛［4］、心肌梗死、充血性心力衰竭、心脏骤停和心源性猝死以及危及生命的哮喘发作［5］、脱敏［6］。因此，哮喘气道高反应的机制及治疗方法亟待研究。

已知高K+导致膜去极化，激活L-型电压依赖性Ca2+通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LVDCC），然后介导Ca2+流入以引发持续收缩［7］。因此，本研究利用高K+诱发去极化导致收缩，离体模拟这一复杂在体过程，此方法可帮助我们快速地筛选抑制气道平滑肌收缩的药物。

研究发现，大黄酸（1，8-二羟基-3-羧基蒽醌，Rhein）减少α-平滑肌肌动蛋白的表达［8］，抑制大鼠离体子宫平滑肌的自发收缩活动［9］，这提示大黄酸可能对气管平滑肌的收缩有影响。本文利用上述筛选平台研究大黄酸抑制小鼠气管平滑肌收缩效应及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8 周龄SPF 级BALB/C♂小鼠，合格证号：42000600027283，42000600027161。购于湖北省实验动物研究中心（湖北武汉），饲养于中南民族大学实验动物中心。实验前7 d，小鼠自由采食，以适应环境。

1.1.2 药品与试剂 大黄酸（上海源叶生物，HPLC ≥98%，批号：T30A8F42628），氯化钠、氯化钾、六水合氯化镁、盐酸、氢氧化钠、无水氯化钙、葡萄糖、二甲基亚砜（DMSO）等购于国药集团化学试剂有限公司。HEPES、硝苯地平（Nifedipine）、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶、牛血清蛋白、二硫苏糖醇购于美国Sig⁃ma-Aldrich。Fura-2，AM（Invitrogen，批号：1179866，美国）。

1.1.3 仪器 JH-2 型张力换能器（北京航天医学工程研究所），HV-4 离体组织器官恒温灌流系统（成都泰盟），EPC-10 膜片钳放大器（HEKA，Lambrecht，德国），TILL 成像系统（FEI Munich GmbH，德国），倒置显微镜（OLYMPUS IMAGING，日本）。

1.2 方法

1.2.1 药物与溶液配置 取适量硝苯地平溶于DMSO 制成浓度为10 mmol/L 母液，-80 ℃保存备用。大黄酸溶于DMSO 配置成100 mmol/L 母液，超声振荡30 min 后，4 ℃保存备用。生理盐溶液（PSS）：135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L 葡萄糖（pH = 7.40）。气管平滑肌及其单细胞分离液：120 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，5.2 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，11 mmol/L 葡 萄糖，0.6 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3（pH =7.10）。将木瓜蛋白酶和二硫苏糖醇一起溶于1 g/L 牛血清蛋白中配置终浓度为2 g/L 和0.3 g/L，胶原蛋白酶溶于1 g/L 牛血清蛋白中配置终浓度为1 g/L。

1.2.2气管环的制备 用颈部脱臼法处死小鼠，剪下气管，去除附着组织，从气管远端剪取4～5 mm 气管环，用两个三角挂钩穿过气管环，挂钩上端连接张力换能器，下端固定于离体器官灌流槽的底部，将气管环前负荷设置为3 mN。槽内充入氧饱和的PSS，保持恒温37 ℃，每15 min 更换一次PSS，共换液4次，完成预平衡。用80 mmol/L K+对气管环进行预刺激，待张力达到平台期后，用PSS 换液，待气管环张力达到基线，25 min 后进行同样的预收缩，共完成3 次，然后开始正式实验。

1.2.3 大黄酸最佳药物浓度的确定 向灌流槽中加入不同体积的大黄酸母液，使灌流槽中的大黄酸浓度累积达到1.00、3.16、10.00、31.60、100.00、177.80 和200.00 μmol/L（以药理学（lg（浓度，mol/L））设定浓度梯度）。对照剂是DMSO。以80 mmol/L K+引起的最大收缩为参考标准计算舒张的程度。

1.2.4 气管平滑肌细胞的分离 剪取小鼠气管平滑肌，置入在37 ℃木瓜蛋白酶中20 min，再移入37 ℃胶原蛋白酶中7 min，然后运用机械力将单个平滑肌细胞分离下来，置冰上备用。

1.2.5 膜片钳记录LVDCC 电流 以Ba2+作为电荷载体测LVDCC 电流。玻璃电极与细胞膜形成高阻抗封接，给予较高负压破膜，形成全细胞记录方式，将细胞钳制在-70 mV，之后记录LVDCC 电流。

1.2.6 细胞内钙测量 2.5 μmol/L Fura-2，AM 在灌流槽中孵育细胞20 min，然后灌流洗去多余染料。利用TILL 钙成像系统采集对应激发波长340 nm 和380 nm 的荧光强度，曝光时间为50 ms，间隔时间为1 s，获取340 nm 和380 nm 荧光强度的比率，用以代表细胞内钙水平。

1.3 统计学分析

数据采用Origin 9.0（OriginLab，美国）进行t-test 数据分析，数据用均数± 标准差（xˉ±SD）表示,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄酸抑制高钾收缩

使用高钾预先收缩了小鼠离体气管环，待收缩达到平台后，大黄酸被累积加入灌流槽中，气管平滑肌的收缩被剂量依赖性地抑制（图1A，n= 6），半抑制浓度（EC50）为（28.4 ± 3.4）μmol/L，最大舒张百分比为（92.7 ± 8.0）%，在对照实验中未观察到此现象（图1B，n= 6）。除去大黄酸后，再次使用高钾收缩，张力值又恢复至第一次预收缩张力值的（92.8 ± 10.7）%（n= 4），大黄酸量效曲线如图1C 所示。此外，本研究发现大黄酸对静息气管环无影响（图1D，n= 4）。该实验结果提示：大黄酸抑制了高钾诱导的小鼠气管环平滑肌的收缩。

图1 大黄酸抑制小鼠气管环的收缩Fig.1 Inhibition effects of rhein on mouse tracheal ring contraction

2.2 大黄酸抑制收缩的机制

已知高钾导致膜去极化，其激活L-型电压依赖性Ca2+通道（LVDCC），该通道介导Ca2+流入引发持续收缩。因此，我们观察了硝苯地平对高钾收缩的影响。结果显示高钾诱导的预收缩被硝苯地平完全抑制。最大舒张百分比为（97.3 ± 1.6）%（图2，n= 7），表明高钾诱导的收缩完全依赖于LVDCC 介导的Ca2+流入。

图2 硝苯地平抑制高钾引发的收缩Fig.2 Inhibition effects of nifedipine on contraction induced by high K+

为了确认Ca2+流入，我们使用图3A 所示程序记录了LVDCC 介导的电流，电流被硝苯地平完全阻断（图3B），同时被大黄酸几乎阻断（图3C），说明大黄酸抑制LVDCC，显而易见，由LVDCC 导致的Ca2+内流应该会随之被抑制。

图3 大黄酸抑制LVDCC 介导的电流Fig.3 Inhibition effects of rhein on LVDCC-mediated currents

这一推测，由细胞内Ca2+直接测量所证实。80 mmol/L K+诱发细胞内钙一过性迅速升高，然后维持在一个较高的平台水平，Ratio（340/380）为（0.44 ± 0.05），加入177.80 μmol/L 大黄酸后，平台恢复至基线水平，Ratio（340/380）为（0.28 ± 0.02）（图4，n= 12）。以上结果表明，大黄酸抑制LVDCC 后，Ca2+内流停止。

图4 大黄酸抑制气道平滑肌细胞内Ca2+浓度Fig.4 Inhibition effects of rhein on intracellular calcium concentration in tracheal smooth muscle cells

本研究进一步在气道平滑肌上验证了上述结论。高钾在无外Ca2+条件下未引起平滑肌的收缩，当外Ca2+浓度恢复到2 mmol/L 后，立即产生收缩，并被177.80 μmol/L 大黄酸抑制（见图5），最大舒张百分比为（88.1 ± 2.1）%（n= 6）,揭示高钾收缩是Ca2+内流所致，此Ca2+内流被大黄酸抑制，然后出现了平滑肌舒张。

图5 大黄酸抑制高K+引发的钙内流Fig.5 Inhibition effects of rhein on calcium influx caused by high K+

3 讨论

哮喘是呼吸系统中最常见的疾病之一，其基本特征是气道平滑肌细胞的收缩异常，这种收缩异常既是哮喘症状又是其恶化的原因，因此抑制气道平滑肌异常过度收缩是治疗哮喘的关键。虽然大黄酸没有改变静息肌张力，但舒张了预收缩的张力。因此，本文着重阐明这一现象的机制。硝苯地平是LVDCC 的选择性阻断剂，显著抑制高K+诱导的气管平滑肌的收缩。在实验完成前后校准并测量了灌洗槽内的pH，pH 与对照相比无明显差异，排除了pH 值对钙离子通道的影响。而大黄酸引起的舒张是由于抑制LVDCC 所致。在平滑肌中，L-型Ca2+通道被认为是主要的Ca2+流入途径［10］，LVDCC 的开放引起细胞外Ca2+大量流入，由此其引发的钙离子内流使得平滑肌收缩，大黄酸抑制LVDCC，阻止钙离子内流，导致了舒张，以上实验结果验证了本文的假设。

大黄酸作为天然蒽醌类化合物在豆科、蓼科、芸香科、百合科中广泛存在，大黄、番泻叶、决明子、何首乌、芦荟等中药材中均含有，其在抗肿瘤、抗炎方面作用突出［11］。已有研究报道其对子宫平滑肌具有抑制作用，此作用可能是由细胞内的前列腺素的合成与释放，或细胞膜上LVDCC 所介导［9］。本研究发现大黄酸对小鼠气管平滑肌收缩具有抑制作用，原因是其抑制了细胞膜上LVDCC。这一结果为开发大黄酸作为一种新的气管扩张剂提供了依据。已知大黄酸可减少α-平滑肌肌动蛋白的表达［8］，是否这是抑制平滑肌收缩的另一原因，还需要进一步的检验。将不同浓度大黄酸与气管环共同孵育培养24 h 后，对α-平滑肌肌动蛋白进行mRNA 和蛋白水平的检测，这是接下来需要进行的研究。

致谢：本实验是在中南民族大学医学生物研究所完成，对在此实验中参与及帮助的同学及老师表示由衷的感谢。