根管湿润度对根管封闭性的影响

陈永菊 李新 潘亚萍 郑丹 商晔 王鹏林

根管治疗术(root canal therapy，RCT)是一种使用特定的器械与仪器清理根管并达到一定形态，药物冲洗根管进行化学消毒，牙胶等充填材料严密填充根管最后进行冠方修复的治疗方法。根管治疗能有效地控制感染，是目前牙髓治疗预防根尖周病和促进根尖病愈合最为有效的治疗手段。根管治疗的目的是完完全全地将整个根管系统的空间封闭，预防组织液、细菌等根管外的影响治疗的因素进入根管，影响治疗效果[1]。有研究表明[2]治疗过程中如果存在不完善的地方会促进微渗漏的形成，微渗漏作为治疗失败的主要原因，在失败原因中所占比重大约为60%。根尖微渗漏(Apical microleakage， AM)是微生物及其产物、血液等外界因素在通过牙胶等材料与根管壁、牙胶自身等彼此之间的细微缝隙[3]，造成失败的根管治疗。根管微渗漏是一个复杂的问题，可被多种因素影响，例如根管湿润情况、根充技术、根管封闭剂的物理化学性能等，且不同的根管冲洗方案均将影响根管封闭性能[4-5]。根管湿润度对整个根管系统的封闭性是最基础的[6]，水量的多少或者是否存在水分将阻碍、减缓或加速促进根充糊剂的凝固过程，降低根管封闭性[7]。到目前为止，微渗漏的研究方法很多，如染料渗入法、液体滤过法、电化学法、放射性同位素渗透法、细菌(内毒素)渗漏法和葡萄糖定量法，目前最简单、最直接和最常用的方法便是染料渗入法[8]，染料渗入法是通过测量染料渗入根管的线性距离来反映微渗漏的大小。根管水分测量仪是一种可对根管内湿润度进行精准测量的仪器，然后通过精准的测量数据建立根管不同湿润度的体外模型，通过一系列相关微渗漏检测试验获得最佳根管湿润度。

本实验通过染色渗透实验和细菌微渗漏实验对根管内不同湿润度对根管充填治疗的影响进行研究，以期获得最佳根管湿润度并能为根管水分测量仪的临床应用提供试验理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 试剂与菌株 5.25% 次氯酸钠溶液、 0.9% 氯化钠溶液(辽宁民康制药有限公司)； AH-Plus糊剂、 氧化锌糊剂、 17% EDTA、 牙胶尖、 吸潮纸尖(Densply, 美国)；印度墨水(北京诺博莱德科技有限公司)；浓硝酸溶液、 无水乙醇溶液(沈阳一化)；冬青油(深圳国鑫香精香料有限公司)；指甲油(上海卓多姿中信化妆品)； 链霉素(沈阳美罗制药)；胰蛋白胨、 大豆蛋白胨、 琼脂粉(Sigma，美国)；硅橡胶印膜材(登士柏，瑞士)。

粪肠球菌标准株：Enterococcus faecalis ATCC19433(中国普通微生物菌种保藏管理中心， 隶属中国科学院微生物研究所)。

1.1.2 仪器 根管水分测量仪(辽宁锦州锦研科技有限公司研发, 图 1); 高速手机、 低速手机(SINOL西诺，德国); K 锉、 GG钻(登士柏， 美国)； 垂直加压器(上海康桥)； 热牙胶充填仪(Bee Fill Pack， VDW， 德国)； 体视显微镜(南京舜宇光学仪器有限公司)； 37 ℃ 恒温CO2培养箱(Thermo Scientific, 美国)； EP管、 冻存管(海门市海克拉斯实验器材有限公司)； 超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)； 微量加样器(Thermo公司， 芬兰)； 恒温鼓风干燥箱(上海医疗器械七厂)； 电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)； 分光光度仪(上海元析仪器有限公司)； 10 ml玻璃瓶(沈阳一化玻商贸有限公司)。

图 1 根管水分测量仪Fig 1 Root canal moisture meter

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养与样品处理 粪肠球菌孵育于由15 mg/ml 胰蛋白胨、 5 mg/ml大豆胨、 15 mg/ml琼脂和5 mg/ml Nacl配比成的胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSAuditor，TSA)， pH值为7.2， 在37 ℃， 5% CO2条件下细菌培养箱中培养。依据菌落形态和革兰氏染色初步证实为粪肠球菌纯培养。挑取单个的粪肠球菌菌落接种至未加入琼脂的TSA液体培养基。使用分光光度仪调整细菌在600 nm处的吸光度值达为0.6备用。

1.2.2 样品采集与处理 收集来锦州医科大学附属第二医院和锦州市口腔诊所拔除的单根管牙齿160 颗，要求牙根发育完好、没有根尖孔损坏、牙根面没有裂痕、没有根面龋、牙根没有内外吸收。5.25% 次氯酸钠浸泡1 h，去除牙石及牙周膜，浸泡在0.9%生理盐水放置在4 ℃保存备用。高速手机截冠，常规开髓、拔髓，GG钻扩根管口，建立直线通道， 10#K 锉插入根管，根尖孔可看到锉尖为止，工作长度为测量长度减1 mm，手用不锈钢器械应用逐步后退法预备根管，17% EDTA去除根管内的玷污层，每次更换器械均使用3 ml 5.25%次氯酸钠液冲洗根管，最后用3 ml蒸馏水冲洗根管1 min。

1.2.3 湿度设定及实验分组 观察本院医生根管充填前干燥根管的过程与步骤，并做好相关记录。在室温下，离体牙体外模拟临床操作过程。并将160 个离体牙根随机分为实验一、二两组各80 颗牙齿，按照临床医生操作，应用根管水分测量仪测定不同干燥方式的湿润程度，记录数据值。

首先将各实验组牙齿根据干燥后测量数值将湿润度分为4 组，仪器的基础值0.250～0.260 V，每组20 个样本。

①湿润度1 组：干燥后含水量值在0.250～0.299 V范围； ②湿润度2 组：干燥后含水量值在0.300～0.599 V范围； ③湿润度3组：干燥后含水量值在0.600～0.899 V范围； ④湿润度4组：干燥后含水量值在0.900～1.199 V范围。根据充填条件不同，每个湿润组内再分为2 个方式组，每组10 个样本。 氧化锌糊剂组：联合热牙胶垂直加压充填技术； AH-Plus糊剂组：联合热牙胶垂直加压充填技术。

1.2.4 根管充填 体外热牙胶垂直加压充填技术的操作步骤：①选取手用垂直加压器3 个，直径由小到大，最小的距离根尖3～4 mm处触碰根管壁； ②试定主牙胶尖； ③调拌适量的根充糊剂并涂布于根管内，将蘸有糊剂的主尖插入根管内； ④携热器先去除根管口外的牙胶，再软化根管上端的牙胶，选用最粗的垂直加压器对牙胶加压； ⑤将携热器插入到牙根中部的牙胶中3 s， 迅速取出并用中号垂直加压器加压； ⑥如⑤一样垂直充填根尖部； ⑦Bee Fill Pack加热牙胶注射充填，并垂直压紧牙胶，完成充填，拍摄X线片检验充填效果。

1.2.5 实验一：染色渗透实验

1.2.5.1 牙齿染色处理 将实验一组内充填好的离体牙标本放置在37 ℃、 100% 湿度的孵育箱中7 d，确保充填使用的根充糊剂完全凝固。除了根管口及根尖孔2 mm以外，实验组的所有牙根外表面均匀地涂上两层指甲油。待指甲油干燥凝固后，将充填好的离体牙试件用线悬挂装有1.5 mm印度墨水的EP管内，将根尖区域沉浸在印度墨水中7 d。

1.2.5.2 牙齿透明化处理 所有牙齿从印度墨水中取出，流动自来水下将染料冲洗干净，手动将指甲油去除。将全部牙齿放入装有10% 硝酸溶液的24 孔板内浸泡5 d， 每24 h更换1 次硝酸溶液。通过小型号针能毫无阻力地刺穿牙齿最后的地方来判断牙齿是否已经完全脱矿。脱矿的牙齿被流动自来水冲洗，然后置于蒸馏水中，每小时更换一次蒸馏水。然后将脱矿牙齿放在呈梯度上升的乙醇中进行脱水，操作如下： 80% 乙醇中脱水过夜， 90% 和100% 乙醇中各脱水2 h。随后将牙齿取出，待在空气中干燥后，将所有牙齿放入到水杨酸甲酯(冬青油)中2 h，完成最后的透明过程(图 2)。

1.2.5.3 染色渗透长度测量 透明化处理后的牙齿，染色渗透长度在体视显微镜下观察并测量，每个样本测量3 次，长度精确到0.01 mm。本实验中采用了标本透明法，可在不损害标本的前提下重复并定量测量染料渗透的长度。

1.2.6 实验二：细菌微渗漏实验

1.2.6.1 细菌微渗漏模型制备 选取另外一组根管充填及湿润度分组后的80牙齿，将牙根涂两层指甲油，细菌渗漏模型由两个腔室组成，制作方法如下：将每个细胞冻存管的末端用刀片整齐的切掉，将离体牙根端置于切口处，用硅橡胶将牙根固定在切口处，外表面涂上两层502胶水，冻存管内牙根根管口以上空间构成了模型的上室；将连结好的上室结构连接到玻璃瓶内，衔接处依然用硅橡胶固定口，并涂上两侧502胶水，玻璃瓶与冻存管之间的空间构成了模型的下室。灭菌后，下室内装有5 ml未加入琼脂的无菌的TSA液态培养基，确保牙根至少有3 mm进入到液态培养基中；上室装有3 ml无菌培养基，以监测渗漏模型(图 3)。

图 2 染色渗漏模型Fig 2 Dye leakage model

A: 细菌微渗漏模型; B: 下室出现浑浊图 3 细菌培养及微渗漏模型建立A: Bacterial microleakage model; B: Turbidity in the lower chamberFig 3 Bacterial culture and microleakage model establishment

1.2.6.2 细菌微渗漏天数检测 将A600=0.6的粪肠球菌的细菌悬浊液置于上室内，每周取出上室内部分培养基更换为新鲜培养基2 次，确保上室内含有活性菌。将所有模型置于37 ℃恒温箱中，每天观察下室的浑浊度，持续100 d， 记录每个泄漏样品的出现浊度的天数。在制备最终装置前按照以上步骤预实验，检测装置连接处用以上方法的密合性。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 应用氧化锌与AH-Plus根充糊剂行热牙胶垂直充填后的X线片

A: 氧化锌糊剂组; B: AH-Plus组图 4 不同根充糊剂充填后X线片观察A: Zinc oxide paste group； B: AH-Plus groupFig 4 Filling results of different root filling paste observed by X-ray film

结果示,应用氧化锌及AH-Plus 2 种不同的根充糊剂充填根管后其X线片结果无显著差异。

2.2 不同糊剂充填方式下，不同湿润度组渗透结果的比较(图 5)

热牙胶配合氧化锌糊剂充填方法中，湿润度1组的染料渗入长度平均为(1.56±0.64) mm，湿润度4组的染料渗入长度平均为(3.60±0.74) mm(P<0.05)； 应用AH-Plus糊剂充填方法中，湿润度1组的染料渗入长度平均为(1.02±0.08) mm，湿润度4 组的染料渗入长度平均为(2.57±0.70) mm(P<0.05)；AH-Plus糊剂组的长度均值小于氧化锌糊剂组，但在相同充填方式下，随着根管内湿润程度的增加，染料渗入的长度也随之增加(图 6)。

2.3 不同糊剂充填方式下，不同湿润度对细菌微渗漏的影响

由表 1可知，不同充填方式下，不同的湿润度组之间，随着湿润度的增加粪肠球菌渗漏到模型下室的天数在逐渐缩短。其中氧化锌糊剂充填组内, 整体分布的Log-rank检验的χ2为9.571，P=0.023<0.05,每组间函数分布不同；AH-Plus糊剂充填组内,整体分布的Log-rank检验的χ2为8.516，P=0.036<0.05,函数整体分布情况不同，且该组湿润度3 组与4 组中还存在100 d观察期结束后，仍然未发生细菌渗漏(图 7)。由此可知，根管内的湿润程度对根管的密封性是有影响的，随着湿润程度的增加，密封程度相对减弱。

图 5 体视显微镜下观测染色渗漏情况(×15)Fig 5 Stain leakage observed under stereomicroscopic(×15)

3 讨 论

根管充填是根管治疗中极为关键的一部分，根尖区的紧密充填能有效的防止根尖周的微生物和冠方组织液二次进入根管，如此降低了细菌及其产物再次定植于根管的机率，尽可能的减少微渗漏的发生，降低根管治疗失败率[9]。根管系统多存在根管侧枝管间交通等细微结构，且结构复杂多变，增加了根管治疗的难度。这些结构在治疗过程中分支细微、不规则，在治疗过程中预备、冲洗、充填时容易被遗漏，从而成为细菌的栖息地。此外即使根管完整的充填治疗了，菌群也会通过微间隙渗漏到细微根管结构与充填材料之间，使得根尖病变经久不愈导致失败的根管治疗。所以根管系统尤其是根尖区的三维充填对于成功治疗根尖病等非常重要。有大量的研究表明[10]根充糊剂用于填补存在于牙胶与根管壁和牙胶与牙胶的空隙，与牙胶彼此互补配合，保证并增加了密封效果，明显降低微渗漏预防根管再感染。

图 6 不同湿润度组微渗漏长度的比较(①： 与湿润度1组比较， P<0.05; ②： 与湿润度2组比较， P<0.05； ③： 与湿润度3组比较， P<0.05；④：与湿润度4组比较， P <0.05)Fig 6 Comparison of microleakage lengths in different wettability(①: vs. group 1, P<0.05; ②: vs. group 2, P<0.05; ③: vs. group 3, P<0.05; ④: vs. group 4， P<0.05)

表 1 不同湿润度对细菌微渗漏天数的比较Tab 1 Comparision of bacteria microleakage under different wetting degree n=10)

根管湿润会对糊剂凝固时间产生一定影响，还可能会对其与牙胶、牙本质的界面有影响，使界面处存在缝隙发生微渗漏。研究表明[11]根管内的湿润度不同会对糊剂的封闭有影响，因此根管湿润度的情况是根管充填前非常重要步骤。有研究者道，在封闭性能上，根充糊剂树脂类的要比氢氧化钙类、氧化锌丁香油类的更加优越[12]，但少数研究认为无论何种材料的糊剂封闭效果没有明显差异[13]。本实验结果显示:采用糊剂AH-plus的比氧化锌的渗漏长度略短，但在相同的充填方法与糊剂的条件下，随着湿润性的增加，渗漏长度也逐渐增加。说明无论氧化锌糊剂还是AH-Plus糊剂的充填材料都是在湿润度最小的组内发生渗漏的程度最小，因此2 种不同糊剂应用说明根管内湿润程度对根充的封闭性是有影响。

图 7 不同湿润度组微渗漏对粪肠球菌生存影响(AH-Plus糊剂组生存函数上的“+”表示100 d观察期结束后，仍然未发生细菌渗漏的模型)Fig 7 Effect of microleakage on the survival of enterococcus faecalis in different moisture degree(Note: The “+” on the survival function of the AH-Plus paste group indicates that there is still no model of bacterial leakage after the end of the 100 d observation period)

本研究的第二个试验方法采用的细菌微渗漏法，使用细菌渗漏的模型的评价方式更接近于临床实际情况，选用的细菌为粪肠球菌(E.faecalis)，把粪肠球菌当做渗漏发生的示踪剂来进行研究。选用此菌的原因如下：①E.faecalis是常驻肠道、口腔等地方的兼性厌氧、革兰阳性的正常寄居菌群。②研究显示，E.faecalis不会或者几乎非常少量的存在于没有治疗过的根管内，然而根管治疗后根管被污染二次发生感染的根管，检验出来的细菌之中，E.faecalis是主要细菌，检出率从22%～77%的都有而且可以达到初次感染根管的9 倍[14]。本研究通过建立细菌微渗漏模型，结果显示，随着湿润度的增加粪肠球菌渗漏到模型下室的天数的均值与中位天数在逐渐缩短。而且随着湿润度的不同，累计函数的分布也不同，且具有统计学差异。

此外，本研究的优势主要在于应用根管水分测量仪(锦州锦研科技有限公司研发)清晰明了的划分根管的湿润度，目前国内外还没有可以测量根管内湿度的口腔仪器。牙根管水分测量仪目前处于初期研究和探索阶段，其关键技术主要包含两大部分：第一，信号转换器探测水分含量。为了达到探测水分含量的目的，信号转换器中包含有驱动电路、发射电路、接收电路、运算放大电路、输出电路等； 工作时，发射电路发射一定频率的电磁波，电磁波穿过挫夹、探针、患者口腔和唇钩组成的回路后，电磁波信号由接收电路接收； 通过运算放大电路比较发射和接收的电磁波强度，我们就能得出水含量的大小。第二，信号的采集与处理。在信号转换器探测出水含量的基础上，我们采用了基于ARM Cortex-M内核的单片机处理系统来采集和处理信号转换器输出的水含量信号。通过染色渗透实验和细菌微渗漏实验来进行微渗漏研究； 此检测方法有以下优点：操作相对简单易控、耗费相对低廉、有较好的实用性和有效性及良好的临床相关性。采用粪肠球菌作为本实验细菌模型所选择的的细菌[15]，把粪肠球菌作为示踪剂来进行渗漏研究，基本设计类似于目前国际上大多数实验模型。

实验的结果显示根管内的湿润程度对根管的密封性是有影响的，随着湿润程度的增加，密封程度相对减弱。本实验通过应用根管水分测量仪定性测量根管壁的湿润程度，从而获得充填最佳的封闭效果，为根管水分测量仪的临床应用提供实验依据。但本实验采用染料渗入及细菌微渗漏法还有一定的局限性：染料渗入法试验中，无论将牙体纵劈、横切还是透明化处理，均不能反应示踪物渗入的体积，因此不能反映微渗量；细菌微渗漏模型同样只能定性得出根管封闭效果。因此对根管水分测量仪的临床应用探究还需进一步做出更为深入的实验，从量上证明根管水分测量仪的临床实用性；其次根管水分测量仪自身也在探索中，以后期为定量测量根管湿润度做出进一步的改进。