微波消融对舌癌Cal-27裸鼠移植瘤凋亡机制的初步研究

张雪松 刘冰 侯春宁 单秋生 林慧 李国林

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤, 目前手术合并放疗或化疗是其治疗的主要方法[1]。由于解剖部位特殊，舌癌术后常影响面部美观及发音，严重影响患者的生存质量。虽然手术技术及辅助治疗手段不断完善,患者5年生存率仍然不到50%[2]。对于一些不能手术治疗或治疗后效果不佳的患者，寻求合适的可以替代手术的辅助疗法十分重要。

微波消融(Microwave ablation, MWA)技术作为一种微创疗法已经广泛应用于临床，其对多种组织的肿瘤，如肝、乳腺、肺、肾及骨组织等都已取得良好的疗效[3-4]，但其应用于口腔鳞癌治疗方面的文献报道少之又少。本研究应用微波消融作用于舌癌Cal-27裸鼠移植瘤模型，观察其对肿瘤细胞的凋亡作用，并结合相关信号转导通路的变化探讨可能的机制，为临床治疗舌癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

BALB/C裸小鼠20 只, 雄性, 4～6 周龄，体重15～21 g(北京维通丽华公司)，舌癌Cal-27细胞株(哈尔滨医科大学转化中心实验室)，MTC-3C型微波消融治疗仪(南京维京九洲医疗器械研发中心)，数字化温度控制器(PKC器械公司,日本)。小鼠抗人PCNAmAb、小鼠抗人Caspase-3 mAb、 SP试剂盒(北京中杉金桥公司)。

1.2 实验动物模型的建立

取对数生长期的舌癌Cal-27细胞，PBS稀释至细胞密度为1×107/ml，于裸鼠右侧腋下接种0.2 ml/每只。接种1 周后裸鼠接种部位皮下出现肉眼可见结节， 2～3 周后待肿瘤长径长至9～10 mm时进行实验。

1.3 治疗方法及实验分组

对裸鼠进行腹腔麻醉，在瘤体旁做一小切口并显露肿瘤，沿肿瘤长轴插入微波消融针至肿瘤中心处。微波功率设为 5 W，测温针置于距肿瘤中心0.5 cm处，温度及时间按分组设定。微波消融采用A组：只插入微波消融针不做微波处理，作为对照组，B组： 50 ℃ 1 min，C组： 50 ℃ 2 min， D组： 55 ℃ 2 min分别作用于裸鼠移植瘤。

1.4 观察指标及标本处理

微波消融结束即刻颈椎脱位处死动物，完整剥离出肿瘤组织。HE染色及免疫组化法:肿瘤组织剥离后，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm。给予HE染色。免疫组化法测定肿瘤组织中Caspase-3、PCNA的表达。按免疫组织化学SP法操作, 经过预试验选择1∶200 和1∶100 分别为PCNA和Caspase-3的一抗稀释度, 二抗为成品液体4 ℃保存随取随用,之后进行DAB显色, 苏木素复染, 同时用PBS替代一抗作空白对照。

1.5 结果判定

PCNA蛋白表达以细胞核内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性,Caspase-3蛋白表达以胞质内出现弥漫的棕黄色颗粒为阳性。在低倍镜下(×100)扫视整张切片，选取5 个视野，然后换成高倍镜(×400)，计算阳性细胞的百分率。表达强度分为：表达阳性细胞百分率<5%计为(-)；阳性细胞百分率5%～25%计为(+)；阳性细胞百分率26%～50%计为(++)；阳性细胞百分率>50%计为(+++)。 总评标准：(-)计为阴性，(+、 ++、 +++)计为阳性。

1.6 统计学分析

应用SPSS 17.0 软件进行统计学分析， 多组样本率组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组移植瘤病理

HE 染色光学显微镜观察各组肿瘤组织病理变化，发现对照组肿瘤细胞整齐排列，核分裂多像多见,瘤块中央有一小坏死灶，少量肿瘤细胞空泡变性，少见凋亡细胞 (图 1A)； 50 ℃ 1 min组肿瘤细胞体积缩小，核分裂像减少，坏死范围加大，肿瘤细胞弥漫性空泡变性，有较多凋亡细胞 (图 1B)； 50 ℃ 2 min组肿瘤细胞体积变小, 核分裂像少, 坏死灶增多，肿瘤细胞弥漫性空泡变性，凋亡细胞增多(图 1C)； 55 ℃ 2 min组可见肿瘤组织坏死明显，大部分肿瘤细胞空泡变性，极少见核分裂像，凋亡细胞较上组少(图 1D)。

2.2 各组移植瘤中Caspase-3和PCNA蛋白表达水平

光镜下观察实验组Caspase-3蛋白阳性表达较对照组明显升高， PCNA蛋白阳性表达较对照组明显降低(图 2)。与对照组相比微波消融各组Caspase-3蛋白的表达率有明显上调趋势(表 1)，PCNA蛋白的表达率有明显下调趋势(表 2)，差异具有统计学意义(P<0.05)。微波消融55 ℃ 2 min组Caspase-3蛋白的表达显著升高(P<0.01)， PCNA蛋白的表达显著降低(P<0.01)。

A： 对照组; B: 50 ℃ 1 min组; C: 50 ℃ 2 min组; D: 55 ℃ 2 min组图 1 各组样本组织病理学图像(HE， ×400)A: Control group; B: 50 ℃ 1 min group; C: 50 ℃ 2 min group; D: 55 ℃ 2 min groupFig 1 Histo-pathological images of the samples of the groups(HE, ×400)

图 2 各组治疗后肿瘤病灶Caspase-3和PCNA蛋白表达(免疫组化， ×400)Fig 2 The expression of Caspase-3 and PCNA protein in tumor lesions after treatment in the groups(IHC， ×400)

表 1 各组微波消融后裸鼠移植瘤组织Caspase-3蛋白表达水平Tab 1 The expression level of caspase-3 protein in the transplanted tumor of nude mice after microwave ablation

表 2 各组微波消融后裸鼠移植瘤组织PCNA蛋白表达水平Tab 2 The expression level of PCNA protein in the transplanted tumor of nude mice after microwave ablation

3 讨 论

微波消融术是近年来发展起来的一种微创的治疗肿瘤的新方法，其原理是通过电磁辐射电荷发生振荡致水分子发生翻转增加动能，摩擦生热，致使周围组织加热，这些热量可以促使肿瘤内的蛋白质变性, 进而诱导肿瘤细胞发生凋亡甚至凝固性坏死。微波消融适合于具有高水含量的组织，目前已广泛应用于肺、肝、乳腺、肾及骨等多种组织良恶性肿瘤的治疗中[5]。然而微波消融治疗舌癌的可行性及疗效评估未得到深入研究。

微波消融的临床治疗通常以测温针采集组织温度来判断组织毁损状态，一般将 60 ℃视为组织发生不可逆凝固毁损的阈值温度。实际消融中，肿瘤周边组织达到 60 ℃即刻或者 54 ℃ 保持 3 min 为肿瘤发生有效毁损的指标[6-7]。本实验采用微波消融治疗舌癌Cal-27裸鼠移植瘤模型，初步确定了治疗舌癌的有效作用温度及时间范围，实验结果显示3组实验组均引起裸鼠移植瘤组织细胞凋亡甚至坏死，与文献报道的有效阈值温度基本吻合。

在对肿瘤的热疗研究中,较多学者的研究方向主要集中在相对较低温度的促肿瘤细胞凋亡[8-9]。凋亡是在一种或多种癌基因活化和或抑癌基因失活的调控下发生的细胞程序性死亡的过程,其在维持机体内环境稳定和组织器官的正常发育中起关键作用。凋亡的异常导致了细胞增殖和分化的紊乱,促进了细胞向恶性的转化,最终导致肿瘤的发生与发展。因此,凋亡异常被认为是肿瘤形成过程中的一个重要机制。

在细胞凋亡的信号途径中,半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate-specific protease-3,Caspase-3)处于细胞凋亡的下游,是凋亡的主要效应分子, 在凋亡过程中起着重要的作用。Caspase-3 处于级联反应的下游，凋亡通路的共同通道上，当上游不同通路引起刺激或者变化后，Caspase-3 均可被激活，参与细胞的异常病理生理过程，从而引起相应细胞质或者细胞核的蛋白异常，导致细胞凋亡[10]。本研究发现微波消融组裸鼠移植瘤模型中Caspase-3蛋白表达量较对照组显著增加，并且消融温度与时间和Caspase-3蛋白的表达量呈正相关。

增殖细胞核抗原(PCNA)是 DNA 聚合酶的辅助蛋白，参与 DNA 的合成，对细胞增殖的启动有重要作用，在细胞周期调控中起重要作用。PCNA 与细胞增殖有密切的联系，其表达高低能直接反应细胞的增殖程度，同时，PCNA表达的降低在许多增生性疾病，特别是癌症的预后中，作为一个评价指标来判断疾病的预后。此外，PCNA 蛋白还参与细胞损伤介导的凋亡与程序性死亡过程。尤其在肿瘤细胞中，PCNA 的表达高于正常细胞，是衡量细胞存活或者凋亡的重要分子[11]，其表达与细胞增殖有关，在许多癌症的诊断中有重要价值。文献报道PCNA基因在口腔鳞癌中高表达，而在正常的口腔黏膜细胞中不表达[12-13]。有学者研究[13]PCNA和 Capase-3的表达呈现出一种显著的负相关,并且这2 种蛋白表达的负相关与癌症密切关联。本研究采用微波消融治疗舌癌Cal-27裸鼠移植瘤模型，通过HE染色及免疫组化方法检测消融范围内肿瘤细胞的凋亡和坏死，从而初步验证了微波消融对于舌癌治疗的有效性，也初步确定了治疗温度及作用时间，为临床上应用微波消融治疗舌癌提供了一定的参考价值。在实验中，由于受限于裸鼠移植瘤大小，微波消融功率选择5W目的在于避免功率过大引起肿瘤组织局部温度过高，同时也便于控制实验温度在一恒定数值。HE染色实验结果证实微波消融可诱导Cal-27细胞发生明显凋亡，免疫组化实验结果显示微波消融组Caspase-3表达较对照组显著增加，PCNA表达较对照组显著降低，并且与作用温度及时间呈正相关，说明微波消融对舌癌的凋亡作用很可能是通过调节Caspase-3和PCNA这两条信号通路的活化水平来实现的。

综上所述，微波消融可以通过抑制舌癌细胞增殖，促进细胞凋亡从而达到治疗肿瘤的目的。本实验为微波消融这一微创疗法治疗舌癌的可能性提供了一定的参考价值，对于一些舌癌晚期不能手术治疗或治疗后效果不佳的患者，若能应用微波消融微创治疗肿瘤就可以减少手术对患者造成的创伤，从而提高生活质量。然而在临床上应用微波消融治疗舌癌还有待进一步研究。