miR—199b促进慢性创面血管化的作用及机制研究

邱尧　岳毅刚　邵家松

[摘要]目的：探索miR-199b對HaCaT细胞增殖、迁移及对VEGFA、JAG1、SET信号通路的影响。方法：转染miR-199b上调与下调慢病毒到人永生化表皮细胞（HaCaT）。分为miR-199b上调（up）、miR-199b下调（dowm）、空载对照（NC组）三个组，进行CCK8、凋亡、周期试验，并采用RT-PCR技术检测VEGFA、JAG1、SET基因的表达，采用WB技术检测miR-199b对下游蛋白变化（如VEGFA、JAG1等分子）的影响。结果：miR-199b up组OD450/fold值显著高于NC组，差异有统计学意义（P<0.05）、miR-199b down组OD450/fold值略低于NC组，差异无统计学意义（P>0.05）。与NC组相比，G1期miR-199b up组与miR-199b down组的细胞增多（P<0.05）；在S期，miR-199b up组及miR-199b down组的细胞减少（P<0.05）；在G2/M期，miR-199b up组及miR-199b down组的细胞减少，差异均具有统计学意义（P<0.05）。与NC组比较，miR-199b up组凋亡细胞百分比下降（P<0.05）、miR-199b down组凋亡细胞百分比上升（P<0.05）；SET在miR-199b up组的表达明显低于NC组，在miR-199b down组表达明显高于NC组。从定量PCR结果可以看出，HaCaT细胞中，miR-199b up组JAG1表达丰度略高于NC组，差异无统计学意义（P>0.05），miR-199b down组JAG1表达丰度明显高于NC组（P<0.05）；miR-199b up组VEGFA表达丰度明显低于NC组（P<0.05）、miR-199b down组VEGFA表达丰度明显高于NC组（P<0.05）；miR-199b up组SET表达丰度小于NC组（P>0.05）、miR-199b down组SET表达丰度明显大于NC组（P<0.05）。结论：miR-199b可抑制VEGF、JAG1、SET蛋白的表达，为其靶基因，可促进细胞的增殖，延长细胞周期，并抑制细胞凋亡。

[关键词]微小RNA；增殖；凋亡；分化；信号通路；慢性创面

[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）01-0089-04

Study on the Role and Mechanism of miR-199b in Promoting Vascularization of Chronic Wound

QIU Yao，YUE Yi-gang，SHAO Jia-song，HUO Qun，ZHANG Min

（Department of Plastic Surgery，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，Guangxi，China）

Abstract： Objective To explore the effects of miR-199b on proliferation and migration of HaCaT cells， as well as VEGFA， JAG1 and SET signaling pathways. Methods Transfection of miR-199b mimics and inhibitor lentivirus into human immortalized epidermal cells HaCaT was performed. The study was divided into three groups： miR-199b up， miR-199b down and no-load control. CCK8， cycle and scratch test were conducted， and the expression of VEGFA， JAG1 and SET genes were detected by RT-PCR， and the downstream protein changes （such as VEGFA， JAG1 and other molecules） were detected by WB technology. Results The OD450/fold value of miR-199b up group was significantly higher than that of NC group （P<0.05）. The OD450/fold value of miR-199b down group was slightly lower than that of NC group （P>0.05）. In the G1 phase， cells in the miR-199b up and down group were increased compared to the control group （P<0.05）. At the S stage， compared with the control group， the cells in the miR-199b up and down group were reduced （P>0.05）. In the G2/M phase， compared with the control group， the cells in the miR-199b up and down group were reduced （P>0.05）. Compared with the NC group， the percentage of apoptotic cells in the miR-199b up group decreased （P<0.05） and the percentage of apoptotic cells in the miR-199b down group increased （P<0.05）. The expression of SET was significantly lower in the miR-199b up group than in the NC group， and significantly higher in the miR-199b down group than in the NC group. According to the quantitative PCR results， the expression abundance of JAG1 in the miR-199b up group was slightly higher than that in the NC group （P>0.05）. The expression abundance of JAG1 in the miR-199b down group was significantly higher than that in the NC group （P<0.05）. The expression abundance of VEGFA in the miR-199b up group was significantly lower than that in the NC group （P<0.05）. The expression abundance of VEGFA in the miR-199b down group was significantly higher than that in the NC group （P<0.05）. SET expression abundance of miR-199b up group was smaller than that of NC group （P>0.05）. The expression abundance of SET in the miR-199b down group was significantly greater than that in the NC group （P<0.05）. Conclusion miR-199b is the target gene of VEGF， JAG1 and SET proteins by inhibiting their expression.It can promote cell proliferation， prolong cell cycle and inhibit cell apoptosis.

Key words： miRNA； proliferation； apoptosis； differentiation； signaling pathways；chronic wound

近年来，IPS细胞诱导并定向分化为血管内皮细胞进而在实验体内形成新生血管的研究越来越受到人们的重视，美国学者Samuel等人使用人体IPS细胞制造出了能在实验鼠体内存活280d的人造血管，并且其表现的生物学功能与正常血管一致。这个发现为糖尿病及心血管疾病等的治疗方法带来了全新的思考，但迄今为止，国内外关于IPS细胞在治疗慢性创面领域的研究报道尚不多见。

基于目前临床上对于慢性创面治疗尚无有效方法的困境，回顾过去胚胎干细胞定向分化血管内皮细胞治疗慢性创面的良好效果，联系当今世界IPS细胞对于再生医学及新生血管形成的重大研究成果，笔者推测：由IPS细胞定向诱导分化的血管内皮细胞可在慢性创面环境中形成新生血管并促进慢性创面血管化，进而加速慢性创面的愈合。目前已有研究显示，miR-199b参与了IPS分化成内皮细胞的过程，并与JAG1和VEGF通路存在靶向关系[1]，但该研究并未探讨miR-199b对内皮细胞的功能影响，如增殖、周期、血管形成等。因此，深入研究miR-199b促进慢性创面血管化的作用及其机制具有重要意义。

因此，进一步探索miR-199b在参与细胞分化形成新生血管促进慢性创面血管化、改善创面血流供应、加速创面愈合的这一过程中可能产生的功能及其作用机制，为推动慢性创面治疗的新方法提供一定的理论依据。现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞：293T（慢病毒的包装细胞）；大肠杆菌菌株DH5 α（用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒）；人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）。

1.2 试剂：GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Scientific）；Thermo Scientific（Generay）；Restriction Endonuclease（NEB）；Taq Plus DNA polymerase（Vazyme）；T4 DNA ligase（Thermo Scientific）；Primer（Generay）；TOP10 competent cell（Genechem）；EndoFree Midi Plasmid Kit（Tiangen）；CCK-8（Sigma）；胎牛血清 FBS（Ausbian）；DMEM（Corning）；凋亡試剂盒（eBioscience）；PI（Sigma）；Rnase A（Fermentas）；Trizol（上海普飞）；M-MLV（promega）；dNTPs（promega）；Oligo（dT，上海生工）；Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（广州锐博）；Rnase Inhibitor（promega）；Primer（R&F，上海吉凯）；SYBR Master Mixture（Takara）；BCA Protein Assay Kit（碧云天）；RIPA 裂解液（强）（碧云天）；RIPA 裂解液（上海鼎国生物技术有限公司）；NP-40裂解液（上海鼎国生物技术有限公司）；Prestained protein marker（Thermo）；ECL-PLUS/Kit（Thermo）。

1.3 仪器：PCR仪（Applied Biosystems公司）；测序仪（美季生物公司）；数显式稳压稳流电泳仪（天能公司）；凝胶成像仪（天能公司）；细菌摇床（华利达实验设备公司）；Blue Pard隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；移液器（吉尔森公司）；超净工作台（苏州佳宝净化工秳设备有限公司）；高速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；生物安全柜（上海振样创空气净化设备公司）；96孔板（Cornning）：血球计数板（求精）；酶标仪（Tecan infinite）；流式细胞仪（Millipore）；荧光显微镜（Olympus）；Nanodrop分光光度计（Thermo）；稳压电泳仪（上海天能）：超细匀浆机（FLUKO公司）；Real time PCR仪器（Roche公司）反转录耗材（Axygen）稳压电源（电泳用，上海天能）；SDS-PAGE 蛋白电泳仪（上海天能）；蛋白转膜仪（上海天能）；冷冻高速离心机（Thermo）；PVDF膜（millipore）。

1.4 实验方法

1.4.1 目的基因载体构建及细胞转染：利用限制性内切酶消化获得线性化慢病毒载体。引物退火制备mir-199b及miR-199b反向序列片段。将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接，将产物直接转化。经测序后，抽提合格的质粒，将其转染至293T（慢病毒的包装细胞）中，构建出miR-199b up慢病毒及miR-199b down慢病毒。培养生长状态良好的HaCaT细胞，进行正式感染，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%～80%左右生长状态良好的细胞，经PCR验证上调与下调成功后，进行下游实验。

1.4.2 CCK-8法检测miR-199b对HaCaT细胞增殖能力的影响： 将使用慢病毒感染的HaCaT细胞分为miR-199b up组及miR-199b down组，并增设加阴性对照病毒感染的细胞作为空白对照组。将三组细胞分别接种于96孔板中，共接种5块板（按检测时间点标记为1d、2d、3d、4d、5d号板），于含胎牛血清FBS的DMEM培养基培养5d。期间分别于第1、2、3、4、5天对相应时间点的96孔板进行检测，检测前，每孔加100?l试剂（其中10?l CCK-8试剂，剩余90?l为含胎牛血清FBS的DMEM培养基）。于4h后将96孔板置于振荡器上振荡 2～5min，选用酶标仪450nm检测OD值。

1.4.3 PI-FACS细胞周期检测mir-199b对HaCaT细胞周期的影响： 分组方式同1.4.2。将3组细胞感染后第3天传代，第4天换无血清培养，第5天换正常培养基，5h后检测miR-199b up、miR-199b down组与对照组处在G1，S以及G2/M期的细胞占细胞总数的比例。

1.4.4 凋亡试验检测mir-199b对HaCaT细胞迁移能力的影响：分组方式同1.4.2。待各实验组6孔板细胞生长至覆盖率约为70%时药物诱导凋亡。若为贴壁细胞，则上清中细胞也需收集。胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一个5ml离心管中，每组设3个复孔。若为悬浮细胞，直接收集。1 300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks（pH=7.2～7.4）洗涤细胞沉淀。1×binding buffer洗涤细胞沉淀1次，1 300rmp、离心3min，收集细胞。200?l 1×binding buffer重悬细胞沉淀，加入10?l Annexin V-APC染色，室温避光10～15min。根据细胞量补加400～800?l 1×binding buffer，上机行流式细胞检测。

1.4.5 Western blot检测SET蛋白表达： 按1.4.2分组，从3组细胞中分别进行蛋白提取。进行SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（分离胶浓度：10%）电泳，结束后转膜、封闭加入一抗（目的一抗SET、内参一抗GAPDH）、二抗（rabbit IgG、mouse IgG），孵育后采用ECL法结合X光片蛋白相对表达量经内参校正后，经Image J软件进行分析。

1.4.6 Real time PCR检测VEGFA、JAG1基因表达：分别对3组细胞进行RNA提取，检测RNA浓度、纯度，采用PCR仪反转录成cDNA，采用Real time PCR仪进行qPCR扩增，检测并比对CT值。

1.4.7 统计学分析：采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，绘图采用Graphpad Prism 6.0软件，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8檢测结果表明：miR-199b up组OD450/fold值显著高于对照（NC）组，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-199b down组OD450/fold值低于NC组（P>0.05）。提示miR-199b up组促进细胞增殖。见图1。

2.5 qPCR检测结果显示：从定量PCR结果可以看出，HaCaT细胞中，miR-199b up组JAG1表达丰度低于NC组（P>0.05），miR-199b down组JAG1表达丰度明显高于NC组（P<0.05）；miR-199b up组VEGFA表达丰度明显低于NC组（P<0.05）；miR-199b down组VEGFA表达丰度明显高于NC组（P<0.05）；miR-199b up组SET表达丰度低于NC组（P>0.05），miR-199b down组SET表达丰度明显高于NC组（P<0.05）。见图5～7。

3 讨论

慢性难愈性创面简称慢性创面，是指经规范临床治疗4～8周后仍难愈合或不愈合的创面。在中国，随着人口老龄化及人们生活水平提高，糖尿病、下肢静脉溃疡等发病率逐年上升，慢性创面发生率越来越高，已严重影响我国的经济与社会发展。创面愈合是一个涉及血管化、上皮化、细胞外基质形成与沉积的复杂过程，大量研究证实，局部血运不良是造成慢性创面难以愈合的主要原因。迄今为止，在慢性创面的治疗上，临床尚缺乏理想的药物及方法[2]。因此，深入研究mir-199b促进细胞增殖的作用及机制，可为IPS细胞分化为血管内皮细胞以促慢性创面血管化，治疗慢性创面的新治疗思路提供理论依据和技术支持，具有临床意义。

MicroRNAs（miRNAs）是一类小的、内源性的非编码RNA，长度约17～25bp，广泛存在于动植物体内，可以调控基因的表达，在人类基因组中30%的基因都受到miRNAs的调控[3]。研究表明[4]，miRNAs在转录后将抑制靶基因表达，越来越多的研究证明此特性在许多癌症的发病机制中发挥着重要作用，也为治疗多种疾病提供了潜在治疗因子[5-8]。通过targetscan数据库预测，MiR-199b可以与VEGFA、SET、JAG1结合，并通过抑制靶基因发挥功能。本次试验中，miR-199b转染人上皮细胞HaCaT细胞，经qPCR检测与对照组相比，miR-199b up组抑制VEGFA，JAG1，SET表达，miR-199b down组促进miR-199b up组抑制VEGFA，JAG1，SET表达，验证miR-199b可以与VEGFA、SET、JAG1结合，并可能通过抑制这些靶基因发挥功能。Western blot检测SET表达结果显示：在miR-199b转染人上皮细胞HaCaT细胞中，相比对照组，miR-199b down组促进SET表达，miR-199b up组抑制SET表达，提示，miR-199b可能靶向抑制SET通路发挥功能。然而本次CCK-8试验、细胞周期试验显示miR-199b对其转染的HaCaT细胞的增殖有促进作用，细胞凋亡试验结果提示miR-199b对其转染的HaCaT细胞的凋亡有抑制作用。本次研究结果显示：转染miR-199b的HaCaT细胞中VEGFA、JAG1、及SET的表达明显降低，细胞增殖加速，细胞凋亡被抑制，考虑此结果可能与细胞周期阻滞水平降低有关。JIAN CAO等[9]在研究miR-146a和miR-21通过调控Notch信号通路共同调控血管平滑肌细胞增殖的过程中发现，转染miR-146a的VSMCs中Notch2蛋白的表达明显降低，但细胞增殖加速，miR-146a和miR-21在动脉粥样硬化斑块中显著上调，并加速血管平滑肌细胞的生长和细胞周期进程。这提示虽然对包括VEGFA、JAG1在内的促细胞增殖作用的靶基因有抑制作用，miRNAs仍可能在某些情况下起到促进细胞增殖的作用。据此笔者推测，在IPS细胞分化为血管内皮细胞的过程中，miR-199b可通过VEGFA，JAG1，SET通路发挥作用，并最终通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡来促进血管内皮细胞的生成，从而改善慢性创面的血供，进而起到促进慢性创面愈合的作用。

综上所述，此次研究显示，miR-199b可能为VEGFA、JAG1、及SET的靶基因，并可促进细胞的增殖与分化，为慢性创面血管化提供了新的治疗思路。

[参考文献]

[1]Li Z，Margariti A，Wu Y，et al.MicroRNA-199a induces differentiation of induced pluripotent stem cells into endothelial cells by targeting sirtuin 1[J].Mol Med Rep，2015，12（3）：3711-3717.

[2]Schreml S，Szeimies RM，Prantl L，et al.Wound healing in the 21st century[J].J Am Acad Dermatol，2010，63（5）：866-881.

[3]王亚波.mir-490-3p对肿瘤细胞增殖及心肌细胞代谢的影响[D].武汉大学，2017.

[4]Wu J，Peng Y，Mao Q，et al.mir-613 inhibits proliferation and invasion of breast cancer cell via VEGFA[J].Biochem Biophys Res Commun，2016，478（1）：274-278.

[5]Hu Y，Li Y，Wu C，et al.MicroRNA-140-5p inhibits cell proliferation and invasion by regulating VEGFA/MMP2 signaling in glioma[J].Tumour Biol，2017，39（4）：1010428317697558.

[6]Zhou X，Chen J，Xiao Q，et al.MicroRNA-638 inhibits cell growth and tubule formation by suppressing VEGFA expression in human Ewing sarcoma cells[J].Biosci Rep，2018，38（1）：BSR20171017.

[7]Hsu CY，Hsieh TH，Tsai CF，et al.miRNA-199a-5p regulates VEGFA in endometrial mesenchymal stem cells and contributes to the pathogenesis of endometriosis[J].J Pathol，2014，232（3）：330-343.

[8]Wu M，Huang C，Huang X，et al.MicroRNA-144-3p suppresses tumor growth and angiogenesis by targeting SGK3 in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Rep，2017，38（4）：2173-2181.

[9]Cao J，Zhang K，Zheng J，et al.MicroRNA-146a and-21 cooperate to regulate vascular smooth muscle cell proliferation via modulation of the Notch signaling pathway[J]. Mol Med Rep，2015，11（4）：2889-2895.

[收稿日期]2018-08-13 [修回日期]2018-09-30

編辑/贾敏

本文引用格式：邱尧，岳毅刚，邵家松，等.miR-199b促进慢性创面血管化的作用及机制研究[J].中国美容医学，2019，28（1）：89-92.