影响脂肪组织工程中细胞外基质支架的相关因素研究进展

曹婷　刘毅

[摘要]支架作为组织工程三要素之一，它主要是作为细胞临时附着点，其降解速度应与组织再生速度相匹配，待组织重建后支架可降解排泄，不对人体造成任何损害。目前研究的组织工程支架主要有天然可降解高分子材料、人工合成的可降解高分子材料、无机材料等，脂肪组织脱细胞基质支架作为近年来的研究热门，因其来源丰富、取材方便，受到研究者们的青睐，本文就影响脂肪组织细胞外基质支架的相关因素综述如下。

[关键词]脂肪组织细胞外基质；脱细胞组织基质；生物支架 ；脂肪组织；可降解性；活性物质

[中图分类号]Q954.65+5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）01-0160-04

Factors Affecting Adipose Tissue Extracellular Matrix Scaffold

CAO Ting，LIU Yi

（Department of Burn and Plastic Surgery ，the 940th of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army， Lanzhou 730050， Gansu，China ）

Abstract： As one of the three elements of tissue engineering， scaffold is mainly used as a temporary attachment point of cells. Its degradation rate should match the rate of tissue regeneration. After the tissue is reconstructed， the scaffold can be degraded and excreted without causing any damage to the human body. Currently， the tissue engineering scaffolds studied mainly include natural degradable polymer materials， synthetic degradable polymer materials， inorganic materials， etc. In recent years. adipose tissue decellularized matrix scaffolds have been studied popularly due to the advantages of its sources and convenience in materials. This article will review the correlative factors affecting the extracellular matrix scaffold of adipose tissue.

Key words： adipose tissue extracellular matrix； acellulartissue matrix； biological scaffold； adipose tissue； degradability； active substance

脫细胞组织基质 （Acellular Tissue Matrix， ACTM）是近年来软组织缺损修复领域的研究热点，通过使用物理、化学、生物的方法对组织进行脱细胞处理， 去除移植物的相关抗原，最大程度地保留细胞外的活性物质及超微结构，获得的生物衍生材料。目前已研发的ACTM包括脱细胞真皮基质、小肠黏膜下基质、心包、心瓣膜、小口径动脉，泌尿系统的膀胱、输尿管及尿道等。脂肪组织由于来源丰富，易于获取，临床应用中不存在伦理学问题，安全性能高，许多研究指出细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）可被完全降解，大约95%的降解产物通过尿液排出，几乎无降解物被宿主吸收。脂肪组织脱细胞基质不仅可作为组织工程的支架，亦可作为独立的软组织缺损填充物，有着巨大的应用潜能。本文主要阐述影响脂肪组织细胞外基质支架的相关因素。

1 脱细胞方法

脱细胞的目标是既要清除干净组织中的细胞成分，彻底消灭组织的抗原性，又要最大程度地保留细胞外基质的3D超微结构、生物活性及组织的完整性。目前脱细胞方法主要有：物理机械法、化学法、生物法。Brown[1]等通过三种不同的脱细胞方法，表明不同脱细胞化方法制备的脱细胞脂肪组织细胞外基质（decellularized adipose tissue extraeellular matrix，DAM）在结构和生物、化学性能上的不同，因此，强调了脂肪组织脱细胞化方案的重要性。

1.1 物理机械法：主要有冻融法（快速冷冻组织后，细胞内冰晶形成，破坏细胞膜，导致细胞溶解，主要通过反复冻融以提高脱细胞的作用）、离心振荡法[2]（将黏附在组织上的血液等液体成分彻底洗涤干净后，低速离心后高速匀浆、离心、冻干等程序后，可得到脂肪组织ECM成分）和压力法[3]，压力法是在一定温度下，将组织完全浸泡于磷酸盐缓冲液中，其中含有一定量的葡聚糖，对其进行缓慢加压，使细胞完整性遭到破坏，造成细胞溶解。压力法对 ECM 非紧密排列的组织或器官效果已得到肯定。

1.2 化学法：去细胞常用的化学方法包括低渗/高渗溶液、离子型/非离子型去污剂、酸/碱处理、螯合剂及有机溶剂萃取。酸和碱可以使细胞质成分有效溶解并破坏核酸，但同时也能破坏其他物质，如细胞外基质中的重要成分糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）。非离子洗涤剂如曲拉通（Triton）X-100）是脱细胞过程中研究及应用较多的，且常与其它洗涤剂配合使用[4]，如和十二烷基硫酸钠（So-dium dodecyl sulfate，SDS）相配合，便可以起到比较好的脱细胞效果[5-6]。高、低渗液是通过渗透压的变化使组织中细胞溶解。螯合剂，如常用的如乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）和乙二醇双四乙酸（ethylene glycol bis（2aminoethyl ether）tet—raacetic acid，EGTA）。细胞与ECM黏附中会出现二价的阳离子，螯合剂可在作用过程中形成印戒状分子复合物，该复合物与二价阳离子相结合，促使细胞与ECM分离。螯合剂在脱细胞过程中的作用主要是辅助金属离子破坏蛋白与蛋白间的联系。EDTA常常和胰蛋白酶联合使用[7]，但单独使用螯合剂不能去除组织表面的细胞，因此，常与酶类或除垢剂相联合，以达到较好的脱细胞效果。众多研究者将生物、物理、化学三种方法与螯合剂联合起来作用于成块脂肪组织，使从中提取的脱细胞脂肪基质能够基本保持其原有的特异性，同时具有诱导 ADSCs 成脂分化的能力[8-9]。

特别是SDS已被证明可以与ECM形成强烈的相互作用，能够改变基质结构。在研究开始后，无论是SDS和脱氧胆酸钠造成不可逆的降解和形成的肿胀结构呈凝胶状物质。另外，SDS难以在处理结束后除去，并能显著地影响细胞活力。也有实验直接使用交联剂EX-810与蒸馏水和超声相配合对组织进行脱细胞处理并取得成功[10]，说明交联剂也具有脱细胞的作用。由于化学脱细胞处理法时间相对较长，不可避免地会有微生物污染，因此，许多去细胞处理方案中也加入青霉素、链霉素等抗生素，或者也可采用电子束照射、γ射线等方法对所得组织进行灭菌处理[11]。

1.3 生物法：主要为酶处理法。包括胰蛋白酶、脂肪酶、中性蛋白酶、核酸酶等。胰蛋白酶是脱细胞中常用的蛋白水解酶之一。一方面是因为它能够破坏组织的亚显微结构，可促进随后脱细胞试剂对组织的渗透，因此，常作为脱细胞程序中的第一步。另外，它是一种特异度比较高的蛋白水解酶，能特异性切断赖氨酸和精氨酸C端的多肽键（邻位不是脯氨酸情况下）。其最适温度为37℃，而对于相同的试剂，作用的时间、顺序和方法不同也会造成不同的结果。脱细胞方案中极小的差别也会大大影响脱细胞效果及所得组织性状，最适pH为8.0。虽然目前胰酶在脱细胞方案中经常用到，但它的脱细胞效果一般，特别对较厚的组织，胰酶无法完全清除组织深部的细胞成分[12-14]。胰蛋白酶对组织也有副作用，对ECM会有不同程度的破坏，其程度与作用时间成正比[15]。胰酶不会影响组织中的胶原含量。相关研究证明弹性组织与胰蛋白酶/EDTA的作用时间越长，弹性蛋白和糖胺聚糖含量就会大量减少，甚至会将组织的抗张强度减少50%[16]。因此，要减少胰蛋白酶对ECM的副作用，就要尽量缩短胰蛋白酶的作用时间。核酶主要作用是引起DNA/RNA的降解，磷酸酯酶A2主要作用为水解细胞的磷脂成分。

此外，相同的脱细胞方案对不同的组织效果不尽相同，脂肪脱细胞基质的制备方法完全决定了所得到的组织细胞外基质天然结构及功能的保留程度，在脱细胞程度最大化前提下，最大可能的保存细胞外基质的生理结构和生物活性，是制备脱细胞生物材料的最终目标。

Flynn[17]结合物理、化学、生物等脱细胞方法。首先将样品在冷冻缓冲溶液进行冻融三个周期（-80℃～37℃），接着用胰蛋白酶消化溶解并用99.9%异丙醇进行极性溶剂提取，去除脂质含量后继续在酶溶液中消化两次。后用DNaseII型（从牛胰脏提取）及RNaseⅢ型A（来自牛胰脏）和VI-S型脂肪酶处理后，再次在99.9%的異丙醇的极性溶剂中提取。得到的组织结构几乎是保存完好的。Masson染色证实了脱细胞的有效性，LN和CIV电镜下可见整体ECM的超微结构在经过加工后是保存完整的。即使高倍率下，微小的纤维化胶原蛋白结构完整，这表明此脱细胞方案对细胞外基质造成的损伤很小。接种ASC并培养24h后行组织学分析表明ASC分布良好，广泛附着并分布在支架上。Suto[18-21]等研究发现在软骨、骨等组织工程中采用反复冻融技术可有效脱细胞，且对细胞外基质的结构和性能无显著影响，且与冻融循环次数无明显关联。范雪娇[22]等人考虑到化学试剂及生物酶处理时间较长，可能影响材料的性能，将Flynn法中的冻融次数由3次增至5次；将胰蛋白酶作用的22h及异丙醇的56h分别缩短至12h和44h，将对组织的总处理时间由5d缩短至4d；并将除冻融外的余作用过程均采用低速震荡，以促进脱细胞液与组织充分作用。经各项检测并证实此改良方法可行。宋玫[23]将脂肪组织反复冻融5次，异丙醇提取12h，胰蛋白酶、DNase-I，RNase-A处理4h后所得到的组织经检测及种植于大鼠皮下均获得成功。田亚菲[24]等将脂肪组织脱细胞后与人脂肪干细胞黏附、培养，并于大鼠体内移植证实了得到的人ACAM具有良好的组织相容性和可降解性，适于细胞增殖及分化；联合人ADSCs在小鼠体内能够成功生成成熟的脂肪组织，可作为一种理想的组织工程支架。

2 影响脂肪组织细胞外基质支架的因素

2.1 脱细胞药物对DAM的影响：Brown等[1]研究表明每次脱细胞方法产生的脂肪ECM支架结构和生物学特性等不同，强调用于产生脂肪ECM支架的去细胞化方案的重要性。Lumpkins等[25-26]报道称异丙醇脱脂效果虽好，但它会与胶原蛋白及黏多糖发生交联反应，使材料表面特性改变；胰蛋白酶具有一定脱细胞效果，但也会一定程度的破坏细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白，影响材料黏弹性[26-27]。Crapo等[27-28]证实材料微结构改变会影响种子细胞的黏附、增殖等细胞相容性，并且此副反应与作用时间成正相关性。

2.2 支架对细胞的影响：脂肪组织支架可影响种子细胞的黏附及生长发育，而不同的材料成分和纳米结构对干细胞的增殖、分化产生的影响也不同。Wu等[29]将脱细胞所得的脂肪基质生物支架与脂肪干细胞复合后证实该支架可以支持干细胞的增殖并且具有促使其向脂肪细胞分化的作用。将此基质植入大鼠皮下，发生较轻微的炎症反应，且移植后的区域生成的脂肪组织同时血管化，周围细胞长入基质中。相关研究证实支架硬度除了影响细胞形态、细胞行为，也影响细胞基因的表达[30-31]。支架微形态也影响着细胞的形态和功能。Kulangara等[32]制备3D支架并将人骨髓间充质干细胞种植于支架进行培养，发现细胞的迁移速度明显较 2D平面的细胞快。Oh等[33]使用离心分离法制备梯度孔径的支架材料，与不同类型细胞进行培养，观察到不同的支架孔径中生长了不同的细胞，如软骨细胞和成骨细胞主要分布于380～405μm，成纤维细胞主要分布于186～200μm孔径，骨细胞主要分布于290～310μm孔径。真空冷冻干燥技术可用于三维多孔生物支架成型，目前主要用于聚合物乳液、多聚糖、水凝胶等材料的支架成型，它以可生物降解的聚合物溶液为对象，以纯水冻结后的冰晶为孔隙源，冻干后的支架孔隙率为91%～95%、孔径范围为20μm～200m，且内部连通性好[34]。

2.3 交联剂对DAM的影响：交联剂可抑制炎性细胞的浸润，可能因为经交联剂处理的组织，其基质蛋白之间形成了阻碍炎性细胞浸润的障碍，并且经交联的基质蛋白，可耐受蛋白酶的降解[35]。交联剂在脱细胞过程中，会改变支架的机械性能。因此交联剂处理的支架，不但抵抗了脱细胞过程的破坏，也能脱细胞和封闭抗原。直接使用交联剂EX-810配合蒸馏水和物理超声脱细胞成功[10]，不但说明交联剂也是一种脱细胞试剂，也证实了交联基质会增加组织对酶降解的抗性，也就是交联剂可以在一定程度上延长人脂肪组织脱细胞基质在体内的停留时间。Brown[37]等研究表明，相同材料，脱细胞彻底的支架较大量细胞存在的支架相比较，新生组织瘢痕前者较后者明显减轻。

3 DAM对组织血管再生的影响

组织工程的最终目标是实现功能性再生受损或缺失的组织。巨噬细胞在组织移植中具有重要作用，在植入生物支架的新血管形成方面，巨噬细胞通过分泌血管生成因子，在序贯激活M1和M2表型巨噬细胞过程中起关键作用。特别是已经证明M1巨噬细胞可以引发血管发芽而M2巨噬细胞亚型刺激周围细胞募集，吻合口和血管重塑[38]。巨噬细胞的转化在血管再生中发挥着非常重要的作用。M1、M2巨噬细胞除促进血管形成外，分泌的促血管生成因子如VEGF、PDGF、TGF-β和bFGF等还可刺激间质干细胞向成纤维细胞、成肌纤维细胞等转化，成纤维细胞、成肌纤维细胞可在缺损处形成肉芽组织促进伤口愈合[39]。Badylak及其同事证明了脱细胞生物支架可诱导巨噬细胞极化朝著更具建设性的表型，这种转变是于组织方面更有利的结果转变[40-41]。

另外，脂肪细胞外基质材料具有极好的可塑性，可制成片状、管状、粉末状等形态，并可通过控制冻存的温度来调节基质材料孔径的大小[42-43]。

4 结语

脂肪组织细胞外基质支架展示了它在组织工程方面巨大的应用潜力。目前，安全无毒、彻底的、可最大程度地保留细胞外活性物质及三维结构的脱细胞方法成为研究热门及难点，作为组织工程细胞支架的生物材料 ，一般必须具有良好的生物相容性、生物可降解性、细胞相容性、一定的力学性能、可加工性及可灭菌性[44]。随着生活水平的提高，抽脂术及腹壁整形等手术的盛行，废弃的脂肪组织等所制备的自体组织生物支架在仿生结构、可塑性、免疫原性等方面都大大优于非自体组织来源的生物材料。而目前已成功商品化的脱细胞真皮基质，成功应用于临床的小肠黏膜下基质、心血管系统的心包、心瓣膜、泌尿系统的膀胱、输尿管、尿道等，预示着DAM成功应用于临床指日可待。

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