鼠李糖乳杆菌发酵提取物在护肤乳液中的抑菌性研究

周龙梅

（山东利尔康医疗科技股份有限公司上海研发中心，上海 201203）

防腐剂在日化产品中的主要功能是抑制细菌繁殖，以防止产品变质或产生毒素，同时防腐剂还有助于产品稳定和产品存储。在公众消费者的压力下，全球各个国家对禁用和限用的日化原料成分的管制更加严格，允许使用的防腐剂将越来越少。

许多学者研究了乳酸杆菌在发酵过程中产生的具有抑菌性能的物质，该物质可用于食品防腐剂[1,2]。Chun Chia Chen[3]等从植物乳杆菌发酵液中提取出的抗菌物质能抑制变种链球菌。A.R.Sarika[4]等从鼠李糖乳杆菌发酵液中提取出了具有抗菌活性的物质，Sigrid C.J.De Keersmaecker[5]等研究了从鼠李糖乳杆菌发酵液中提取的抗菌物质能抑制鼠伤寒沙门氏杆菌。本研究参考文献[6,7]从鼠李糖乳杆菌发酵液中提取出抗菌活性物，该物质经实验验证对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌具有抑菌性能。将此抗菌物质添加至护肤乳液中能有效抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌繁殖。该抗菌物质添加到护肤品中，能抑制细菌繁殖，从而可延长产品货架期，可以作为日用护肤品中合成防腐剂的替代品。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

大肠埃希菌（Escherichia coli ATCC 8739）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）；白色念珠菌（Candida albicans （ATCC 10231）；以上菌种由中国普通微生物菌种保藏中心提供。

营养培养基、营养琼脂培养基、沙氏培养基、沙氏琼脂培养基，稀释液（质量分数为0.85%灭菌生理盐水）。

FM200弗鲁克均质搅拌器，上海弗鲁克科技发展有限公司； HJ-3磁力加热搅拌器，常州峥嵘仪器有限公司。

1.2 鼠李糖乳杆菌发酵液提取物制备

参照文献[6,7]。鼠李糖乳杆菌在特定培养基中进行28 h静置发酵培养，发酵液在75 ℃水浴中加热1 h以灭活发酵液中的酶，发酵液冷却后用质量分数20%的氢氧化钠溶液调节酸碱度为6.5左右搅拌1 h，在5 ℃、7 500 r·min-1离心10 min，去除上清液收集沉淀，以去除发酵液中的过氧化氢、酶等物质，沉淀用质量分数0.85%的灭菌生理盐水悬浮洗涤2次，每次0.5 h，悬浮液在5 ℃、7 500 r·min-1离心10 min，去除上清液收集沉淀，进一步去除过氧化氢、酶等物质，2次洗涤后的沉淀用质量分数2.0%乳酸溶液进行搅拌悬浮1 h，乳酸溶液用量为鼠李糖乳杆菌发酵液的1/30，悬浮液在5 ℃、7 500 r·min-1离心10 min，收集上清液去除沉淀，上清液再经0.2 μm的微孔膜进行过滤得鼠李糖乳杆菌发酵液提取物。

质量分数2.0%乳酸溶液的配制：在灭菌后的特定培养基溶液中加入氯化钠至质量分数为0.85%，然后加入乳酸至乳酸质量分数为2.0%，盐酸调节pH为4.36，经过0.2 μm的微孔膜过滤得到含质量分数为2.0%乳酸溶液。

采用凯氏定氮法[8]测定发酵提取物中蛋白质质量分数。

1.3 抑菌圈实验

抑菌圈实验方法参考2002年版《消毒技术规范》。

将指示菌细菌在液体营养培养基中活化，35 ℃新鲜培养20 h，取菌悬液1 mL至9 mL稀释液中进行稀释，稀释至一定浓度（约108CFU·mL-1）；指示菌白色念珠菌在沙氏液体培养基中活化，35 ℃新鲜培养20 h，取菌悬液1 mL至9 mL稀释液中，稀释至一定浓度（约106CFU ·mL-1）。

先将6 mL固体培养基平铺于平板中，置于水平台面上静置凝固，分别取1 mL稀释至约108CFU·mL-1细菌或106CFU ·mL-1白色念珠菌的新鲜培养指示菌与10 mL融化并温热的固体培养基（细菌为营养琼脂培养基，白色念珠菌为沙氏琼脂培养基）混匀，倾倒于平板中。将平板打开盖使无菌空气流通约0.5 h以利于细菌素扩散。将牛津杯轻轻放置于平板上，将200 μL鼠李糖乳杆菌发酵液提取物样品加入牛津杯后于4 ℃冰箱中扩散5 h，然后35 ℃培养24 h观察抑菌圈。

1.4 护肤乳液样品的配制

配方组成：I相：乳化剂（硬脂酸甘油酯、PEG-100硬脂酸酯），质量分数3.0%；硬脂醇，质量分数0.5%；异壬酸异壬酯，质量分数3.0%；二辛基醚，质量分数3.0%；生育酚乙酸酯，质量分数0.5%。黄原胶，质量分数0.3%；质量分数为10%柠檬酸溶液，适量；1,3-丁二醇，质量分数5.0%；水加至质量分数100%。

将I相混合加热至75 ℃，同时将水和1,3-丁二醇混合加热至75 ℃，然后将I相加入到水和1,3-丁二醇混合物中3 000 r·min-1均质20 min，冷却至40 ℃加入黄原胶，3 000 r·min-1均质2 min后加入质量分数为5%鼠李糖乳杆菌发酵提取物，再用柠檬酸溶液调节pH得护肤乳液样品。

以不添加鼠李糖乳杆菌发酵提取物、10%柠檬酸溶液调节pH为5.0的护肤乳液作为对比样。

1.5 抑菌实验

抑菌实验方法参考美国药典USP＜51＞ Antimicrobial effectiveness testing。

将1 mL培养好的指示菌液至9 mL稀释液中进行稀释，将指示菌稀释为1×108CFU·mL-1～1×109CFU·mL-1的菌悬液，确定细菌数。

将含鼠李糖乳杆菌发酵提取物的护肤乳液调节pH为5.0、6.0、7.0进行挑战测试，评估其抑菌性能。将大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌接种至含有鼠李糖乳杆菌发酵提取物乳液样品中培养28天，在此期间定期测试样品中存活微生物。

分别称取pH为5.0、6.0及7.0含有鼠李糖乳杆菌发酵提取物待测乳液样品100 g，分别倒入9个带盖容器中；称取对比样品100 g，分别倒入3个带盖的容器中；分别标记大、金、绿、pH及日期。

分别在9个容器中对应加入1 mL 1×108CFU ·mL-1～1×109CFU ·mL-1的细菌菌悬液，混匀后盖上盖子；在对比样品中对应加入1 mL 1×108CFU ·mL-1～1×109CFU ·mL-1的细菌菌悬液，混匀后盖上盖子，置于（32.5±2.5）℃的培养箱中培养。

分别在7天、14天、28天分别计算样品中活的细菌。每次计算完细菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免染菌而使下次无法观察。

2 结果与讨论

2.1 发酵提取物中蛋白质含量及酸碱度测定

采用凯氏定氮法测定鼠李糖乳杆菌发酵提取物中蛋白质含量，由测定结果可知，鼠李糖乳杆菌发酵提取物中蛋白质质量分数为0.246 4%；按照2002年版《消毒技术规范》中pH测定方法测定发酵提取物pH为4.36。

2.2 鼠李糖乳杆菌发酵提取物抑菌圈实验

图1为鼠李糖乳杆菌发酵提取物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的抑菌圈实验，图中1表示鼠李糖乳杆菌发酵提取液抑菌圈，2表示质量分数为2.0%乳酸溶液抑菌圈。经测定鼠李糖乳杆菌发酵提取液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌抑菌圈直径分别为19、23和24 mm，鼠李糖乳杆菌发酵提取物中的蛋白质具有一定的抑菌性；质量分数为2.0%乳酸溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌均无抑菌圈；发酵提取液和乳酸溶液对白色念珠菌均无抑菌圈。

图1 抑菌圈实验Fig.1 Inhibition zone test

2.3 含鼠李糖乳杆菌发酵提取物乳液抑菌实验

2.3.1 对大肠埃希菌抑菌实验

图2为乳液对大肠埃希菌的抑菌实验。从图2中可以看出，对比样品在第14天及28天大肠埃希菌数量略有增加，说明对比样品对大肠埃希菌没有抑菌作用。pH为5.0、6.0及7.0的含有鼠李糖乳杆菌发酵提取物的乳液在第7天对大肠埃希菌的抑菌率都能达到99.9%，14天、28天活菌数持续减少，抑菌率持续增大；从图中还可以看出，pH影响鼠李糖发酵提取物对大肠埃希菌的抑菌性能，pH为5.0时对大肠埃希菌的抑菌性能最好。

图2 乳液对大肠埃细菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of the lotion to Escherichia coli

2.3.2 对金黄色葡萄球菌抑菌实验

图3为乳液对金黄色葡萄球菌的抑菌实验。从图3中可以看出，对比样品在第28天金黄色葡萄球菌数量略有增加，说明对比样品对金黄色葡萄球菌没有抑菌作用。pH 为5.0、6.0及7.0的含鼠李糖乳杆菌发酵提取物的乳液在第7天对金黄色葡萄球菌的抑菌率都能达到99.9%， 14天活菌数持续减少，28天pH6.0及pH7.0抑菌率持续增大，在28天pH5.0活菌数略有增加。

图3 乳液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用Fig.3 Antibacterial effect of the lotion to Staphylococcus aureus

2.3.3 对铜绿假单胞菌抑菌实验

图4为乳液对铜绿假单胞菌的抑菌实验。从图4中可以看出，对比样品在第28天铜绿假单胞菌数量几乎不变，说明对比样品对金黄色葡萄球菌没有抑菌作用。pH为5.0、6.0及7.0的含有鼠李糖乳杆菌发酵提取物的乳液在第7天对铜绿假单胞菌抑菌率都能达到99.9%， 14天、28天活菌数持续减少，抑菌率持续增大；从图中还可以看出， pH为5.0和 6.0时其抑菌性能相差不大。

图4 乳液对铜绿假单胞菌的抑菌作用Fig.4 Antibacterial effect of the lotion to Pseudomonas aeruginosa

3 结论

鼠李糖乳杆菌发酵提取物含有一定量的蛋白质，该蛋白质对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌具有显著地抑制作用，对白色念珠菌没有抑制作用。添加质量分数为5%的鼠李糖乳杆菌发酵提取液于护肤乳液中，能有效抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌。