MDCK单克隆细胞的制备方法研究

张松，张丽，乔自林，王家敏，马桂兰，侯兰新*

(1.西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞工程技术创新中心，甘肃 兰州 730030； 2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030； 3.兰州民海生物工程有限公司，甘肃 兰州 730010)

MDCK细胞系(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)是从母曲架犬肾组织中分离培养而获得的上皮样贴壁细胞，该细胞系可连续传代[1]。MDCK细胞对各种流感病毒均较为敏感，已广泛应用于流感病毒的感染和检测等领域[2]。人流感病毒主要通过与MDCK细胞上的受体结合感染细胞，但细胞表面的流感病毒受体的类型和数量存在着个体差异[3]，流感病毒在同种细胞不同个体的细胞内复制效率也存在高低差异。因此，通过有限稀释法制备MDCK单克隆细胞库，为筛选工作提供实验细胞基础显得尤为重要。流感全称为流行性感冒，是由流感病毒引起的一种呼吸道疾病[4]。流感病毒感染是由其表面的血凝素蛋白(HA蛋白)与宿主细胞膜表面上的糖链受体唾液酸(sialic acid，SA)共同介导而完成的，人流感病毒HA蛋白主要识别末端为唾液酸-α-2,6-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)的糖链受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面[5]。接种流感疫苗被认为是预防流感发生和流行的有效手段[6]。生产流感疫苗的传统手段是利用鸡胚培养系统，由于使用鸡胚培养流感病毒常常会导致外源性污染、病毒变异、不同培养批次的流感病毒滴度不一致，因而难以迅速应对流感大流行[7-8]。因此，急需开发一种可以大规模生产流感疫苗的理想的方法。采用大规模细胞培养技术与流感病毒的生产结合被认为是最具潜力的发展方向[9]。本研究拟采用有限稀释法探索MDCK单克隆细胞株的最优制备条件，提高MDCK单克隆细胞株的制备效率，为流感病毒的后续研究提供细胞资源和有价值的参考依据。

1 材料与方法

1.1 MDCK细胞系

MDCK细胞系购自ATCC(CCL-34)，由甘肃省动物细胞工程中心于-198 ℃液氮罐保存。

1.2 主要试剂

胎牛血清和新生牛血清均购自兰州民海生物工程有限公司；DMEM培养基和0.25%胰酶均购自兰州百灵生物技术有限公司；配制PBS(无Ca2+、Mg2+)缓冲液。

1.3 主要仪器设备

CO2细胞恒温培养箱(上海博讯公司)，生物倒置显微镜(日本奥林巴斯光学科技有限公司)，Countstar自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)等。

1.4 细胞培养

将储存于液氮罐中的MDCK工作库细胞取出，37 ℃水快速融化后置于50 cm2培养瓶中，补加培养基后再置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待MDCK细胞生长至致密单层时，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，缓慢摇动细胞培养瓶使胰酶充分没过细胞表面，将细胞放回培养箱内继续消化5 min，取出在显微镜下观察。当细胞全部变圆开始脱落时弃去胰酶，并在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中继续放置3 min，取出倒去胰酶加入15 mL DMEM培养基，将细胞吹打混匀后按1∶4比例传代，继续将细胞放入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.5 数据处理

试验所获数据采用SPSS 21.0软件中的单因素方差分析和LSD法多重比较。

2 结果与分析

2.1 血清类型对制备MDCK单克隆细胞的影响

血清类型是影响制备MDCK单克隆细胞数的主要因素，胎牛血清制备的单克隆细胞数为(9.50±0.19)，明显高于新生牛血清(5.25±0.56)。

2.2 血清类型对MDCK单克隆细胞株状态对比

观察MDCK单克隆细胞在胎牛血清和新生牛血清中的生长形态，不同血清培养的MDCK单克隆细胞在形态和生长特性方面没有很大差异，均呈典型多角上皮样形态(图1)。但细胞在不同的血清培养条件下生长状态不同，胎牛血清培养的细胞生长速度较新生牛血清快。同传代比例生长48 h，胎牛血清培养的MDCK细胞汇合度可以达到95%，而新生牛血清培养的MDCK细胞汇合度只有80%。表明胎牛血清在MDCK细胞的体外增殖过程中，可使细胞增殖更加活跃。胎牛血清培养的MDCK单克隆细胞，长满单层后均匀分布，细胞胞质丰满，核仁清晰。新生牛培养上清液较胎牛血清上清液浑浊，细胞上清液中细胞出现脱壁现象，死亡细胞增多。因此，用胎牛血清制备的MDCK单克隆细胞生长状态更好。

图1 胎牛血清与新生牛血清制备MDCK单克隆细胞株状态对比

2.3 胎牛血清浓度对制备MDCK单克隆细胞的影响

胎牛血清浓度和单孔理论接种密度是影响有限稀释法制备MDCK单克隆细胞效率的主要因素。实验结果表明，15%胎牛血清的单克隆细胞数为(7.38±0.65)，高于10%胎牛血清的单克隆细胞数(5.75±0.65)，有助于制备更多的MDCK单克隆细胞；单孔理论细胞密度值为1个·孔-1时，制备的MDCK单克隆细胞数为(9.50±0.19)，极显著高于0.5个·孔-1(8.00±0.01)和2个·孔-1(3.50±0.57)2个密度(P<0.01)。

3 讨论

流感对人类健康威胁严重，其发病率为各种传染性疾病之首，是严重危害人类健康的重要传染病之一。据世界卫生组织报告，全球每年约有6亿～l2亿人感染流感，其中死亡人数高达50万～100万人，给人类健康和经济造成了巨大危害和损失。特别是近年来人感染高致病性H5N1禽流感，以及2009年在墨西哥暴发的甲型H1N1流感，再一次给人们敲响了警钟，人类流感的防控极为重要。流感病毒表面抗原时常发生变异[11]，及时接种疫苗是预防流感最有效的方法。目前，流感疫苗的主要生产介质是鸡胚，然而由鸡胚来源的疫苗存在着质量难以控制、生产周期长、易引起过敏等问题，一旦流感暴发，其来源将成为瓶颈，无法及时应对流感疫情。因此，开发新的人用流感疫苗生产介质已成为疫苗生产的关键，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐细胞是生产疫苗的优良介质。MDCK细胞系是1958年Madin等从美国一头Cocker Spanie母曲架犬的肾脏组织中分离培养建立得到的细胞[12]。该细胞形态呈上皮细胞样，贴壁生长，可连续传代，具有易培养、增殖快、流感病毒感染效率高等特点，被用作流感病毒疫苗生产的重要细胞系。

牛血清是生物医药领域公认的培养细胞的一种重要原料，含有丰富的细胞生长必需的营养成分，如蛋白质、激素、生长因子、贴壁因子和多肽类物质等[13-14]，支撑着细胞的生长和正常增殖，为顺利进行细胞体外培养提供了必要的营养保障[15-16]。我国使用最多的是胎牛血清和新生牛血清，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)是在屠宰怀孕母牛的时候，通过心脏穿刺采血获取的胎牛血清；新生牛血清(newborn bovine serum，NBS)是指出生14 h内未进食的健康新生牛采集分离的血清原料进一步精制而成[17]。胎牛血清绝大部分的物质来源于母体,含有丰富的胚胎发育过程中必需的一些生长因子和激素等；新生牛血清的这些成分相对较少，随着犊牛月龄的增长,血清中的抗体、补体等成分增加，而这些大分子蛋白质是一种异源物质，给细胞增殖带来不利影响。大量的脂蛋白、纤维蛋白以及多肽类物质在低温保存解冻过程中会自然形成很多沉淀。有限稀释法是一种单细胞培养技术，通过将细胞稀释至每孔只有单个细胞后进行培养而获得单克隆化细胞株的目的。该方法适用于细胞纯化，突变细胞株的选择和分离，是培养单克隆细胞株的常用方法[10]。一个细胞克隆株中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞，故称之为单克隆细胞(monoclonal cell)。本研究中新生牛血清培养的MDCK细胞中发现有少量的杂质悬浮于细胞液中，细胞贴壁后杂质便贴附于细胞上，影响细胞的生长和单细胞孔的标记。马桂兰等[18]研究发现，在培养单克隆细胞时，细胞失去了群体效应支持，生长变得艰难，使用胎牛血清的效果比新生牛的更好。血清的质量直接关系到研究进度和生产效益，血清选择不当可能会造成细胞增殖缓慢甚至导致细胞不增殖，推迟科研进度，导致不必要的损失。因此，研究不同血清对有限稀释法制备单克隆细胞的影响具有很重要的意义。本研究血清对比结果显示，使用胎牛血清制备MDCK单克隆细胞对细胞生长状态、生长速度及单细胞孔的标记角度更加理想。

细胞培养中使用的血清浓度一般为0.5%～30%[19]。血清浓度过高会导致细胞生长过快，相悖于MDCK细胞的正常生长周期；浓度过低会导致细胞生长过慢甚至死亡[20]。马萍等[21]研究表明胎牛血清含量为5%～15%时，MDCK细胞形态正常，细胞均能长成片。MDCK细胞在不同浓度的胎牛血清下生长趋势也有很大不同。本研究显示，MDCK细胞在低浓度血清培养条件下生长状态不佳。因此，设定10%和15% 2个胎牛血清浓度，探究其与制备MDCK单克隆细胞效率的相关性，结果表明血清浓度与制备MDCK单克隆细胞效率二者之间高度相关，有限稀释法利用15%胎牛血清浓度制备MDCK时效率明显提升。单孔细胞浓度是影响有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株的重要因素。随着单孔细胞浓度的升高，MDCK单克隆细胞制备效率呈现先上升后快速下降的趋势。本研究结果显示，单孔细胞浓度与制备单克隆细胞数目有正相关性，在1个·孔-1时，通过有限稀释法制备的单克隆细胞数目最多，相比另外两浓度具有明显优势。与2个·孔-1的单孔细胞浓度相比，0.5个·孔-1单孔细胞浓度时制备MDCK单克隆细胞株在单孔标记操作更加简单快速，省时节力。

随着利用细胞大规模培养技术生产流感疫苗的研究热度越来越高，高效制备MDCK单克隆细胞株也逐渐成为研究重点，可相关实验参数条件均处于探索阶段。本研究采用有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株，胎牛血清浓度为15%，96孔细胞培养板单孔接种密度为1个·孔-1时，可以较高效制备MDCK单克隆细胞株。本研究建立的MDCK单克隆细胞库为开展MDCK细胞及流感细胞基质疫苗的研究提供了细胞资源，探究了有限稀释法制备MDCK单克隆细胞的实验参数条件，可为今后制备单克隆细胞并开展流感疫苗相关研究提供基础理论依据。