miR-27a与糖尿病肾病发病机制的研究进展

张馨心，杨 敏,白彝华

(昆明医科大学第二附属医院肾脏内科，昆明 650101)

糖尿病是目前世界上患病率增长最快的代谢紊乱性疾病之一，截至2013年，世界范围内约有糖尿病患者3.82亿，预计到2035年会上升至5.92亿[1]。世界上每年因糖尿病相关性疾病死亡的人数多达320万[2]。糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)在临床上主要表现为高血压、持续性蛋白尿、进行性肾功能损害、心血管疾病的发病率及病死率增加等，是糖尿病微血管并发症之一，也是终末期肾病最常见的原因。DKD的主要病理特点是足突融合、系膜细胞增殖肥大、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蓄积和基膜增厚，最终形成结节状硬化(Kimmelstiel-wilson结节)，伴肾小管肥大、小管基膜增厚和间质纤维化。足细胞数量减少及凋亡也预示着DKD的进展[3]。

微RNA(microRNA,miRNA)是内源性单链高保守小非编码RNA[4]，通过与靶向mRNA的3′-非翻译区(three prime untranslated region,3′-UTR)中的互补序列结合，负向调节靶基因表达水平。对细胞的生长、分化、增殖、凋亡起重要调节作用，与许多疾病的发病机制有关。研究表明，多种miRNA在DKD进程中起关键作用，如miR-192、miR-24、miR-29a等[5-7]。目前有关miR-27a的相关机制研究主要集中在抗肿瘤领域，也涉及对脂代谢、动脉硬化[8]、心血管疾病[9]、炎症、氧化应激、肾素-血管紧张素系统[6]、胰岛素抵抗[10]的影响，但其对DKD进程的作用机制还不明确。现就miR-27a与DKD发病机制的研究进展予以综述。

1 miR-27a通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ信号通路影响DKD

1.1介导足细胞损伤 足细胞即肾小球囊脏层上皮细胞。足细胞的足突参与构成肾小球的滤过屏障，同时对维持肾小球滤过屏障的完整性有重要作用。足细胞损伤是引起蛋白尿的关键因素，其结构完整性受损或数量减少可引起糖尿病性或非糖尿病性肾小球疾病中蛋白尿的产生及肾小球的纤维化[11]。足细胞特异性分子(足细胞裂隙膜蛋白、足细胞特异性突触连接蛋白)减少会导致足细胞损伤及上皮间充质转化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)增强[12-13]。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是细胞增殖分化中的重要调节因子。PPAR家族包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，在多基因调节中起重要作用。不同亚型分布于不同组织，PPARγ广泛分布于心、肾、脾及小肠，具有调节脂肪生成、炎症、细胞增殖和分化及糖代谢的作用[14]。

miR-27a通过miR-27a/PPARγ/β-联蛋白轴介导足细胞损伤，受损的足细胞与系膜细胞间的信号传递或由于足细胞丢失引起的血流动力学因子产生，可刺激系膜细胞ECM合成增加及降解减少，加重DKD进展。研究表明，高糖环境下，足细胞中的miR-27a表达水平上调，且其表达水平呈现出葡萄糖作用时间及浓度依赖性[15]。PPARγ为miR-27a的直接下游靶基因。miR-27a直接与PPARγ mRNA的3′-UTR特异性结合，引起PPARγ的磷酸化。由此激活β联蛋白及其下游靶基因锌指转录因子1、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)[16]，同时，因α-SMA基因的启动子中含有2 个Smad3反应区，Smad3可促进α-SMA的表达[17]，因此该信号通路对于EMT也有影响，能促使肾小球和肾小管、肾间质纤维化，从而引起一系列β联蛋白依赖性足细胞改变，如EMT增强、足细胞特异性标志减少、足细胞凋亡等，导致足细胞的数量减少、肾小球的结构完整性受损、肾小球基膜受损、裸露以及球囊粘连等[18]。通过靶向PPARγ,miR-27a能引起DKD中不同类型细胞的下游信号通路激活，从而共同加剧疾病的恶化。

1.2促进肾组织纤维化 肾脏纤维化是各种原因导致的慢性肾脏病，包括原发性、继发性肾小球疾病、肾小管、间质及血管疾病以及肾脏移植慢性排斥性病变进展成为终末期肾病的最后共同通路[19]。肾组织纤维化的主要病理特征为肾脏丧失了原有正常的肾单位结构，包括肾小球硬化、肾小管间质纤维化等。DKD中肾小球硬化主要继发于系膜细胞、足细胞损伤，肾小管易受组织缺氧、炎症、高糖环境及免疫因子损伤等影响，随着刺激时间的延长，肾组织纤维化产生[20-21]。以大量成纤维细胞、肌成纤维细胞增殖以及EMC(胶原纤维、纤粘连蛋白等)的产生蓄积为特点，同时常伴有肾小血管的硬化，最终导致肾功能损伤甚至丧失[22-24]。肾小球硬化由肾小球系膜细胞、足细胞及肾小管上皮细胞等多种细胞损伤共同参与，是DKD的主要病理改变[25-26]。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在DKD中的生物学活性主要表现为促进肾脏组织纤维化进程。①对ECM的影响。TGF-β1对ECM蛋白的调节作用主要包括两个方面：增加其合成，通过激活基质降解抑制酶(如组织金属蛋白酶抑制剂以及纤溶酶原激活物抑制剂)的活性实现；减少其正常降解，主要通过抑制基质降解酶(如基质金属蛋白酶和纤溶酶原激活物)的活性实现。两者共同导致ECM沉积，包括基膜成分(Ⅳ型胶原、硫酸肝素、Laminin等)和间质成分(Ⅰ型、Ⅲ型胶原、纤粘连蛋白等)。②对细胞增殖方面的影响。TGF-β1可抑制上皮细胞的生长，如肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞以及支气管上皮细胞等；同时对内皮细胞的增殖也有一定的抑制作用；对于间充质源性的细胞有双重调节作用，即高浓度时抑制而低浓度时促进其增殖[22]。TGF-β1能诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，从而促进ECM的产生及蓄积[27]。TGF-β1的促纤维化作用主要依赖于转录因子Smad3介导的细胞内信号激发，Smad蛋白家族是TGF-β1受体的作用底物。TGF-β1实现促肾组织纤维化主要通过TGF-β1/Smad信号通路途径：TGF-β1能通过磷酸化作用使Smad2和Smad3激活，激活后的Smad2、Smad3随后与共用Smad4结合，形成复合体进入细胞核与靶基因结合调节基因的转录及转录后修饰。此外，TGF-β1/Smad信号通路在诱导肌成纤维细胞分化过程中对α-SMA基因表达具有调节作用[18]，两者能共同引起ECM的产生导致纤维化。但部分非Smad通路也可能参与促肾组织纤维化进程[25]。TGF-β1信号通路除通过诱导EMT外，还能诱导生理或病理条件下的内皮-肌成纤维细胞转化，肾脏内皮细胞通过内皮-肌成纤维细胞转化在早期DKD的纤维化进程中发挥作用。TGF-β1/Smad3信号通路能诱导巨噬细胞-肌成纤维细胞转化，巨噬细胞-肌成纤维细胞转化是能够产生大量胶原纤维的α-SMA+肌成纤维细胞的重要来源，该过程能促进肾脏纤维化[28]。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对维持ECM的动态平衡起关键作用。CTGF能增强间充质细胞中ECM的生成、细胞黏附以及胶原基质的收缩，通过von Wille-brand因子C结构域与TGF-β1结合，使其与受体的结合能力增强，增加TGF-β1的水平，并参与调节其信号转导[29]。TGF-β1/Smad3信号刺激CTGF的表达，促进EMT、刺激成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，在纤维化进程中起关键作用。

miR-27a作为miR-27a/PPARγ/TGF-β1/Smad3信号通路中TGF-β信号转导的上游调控因子而存在，miR-27a通过直接靶向PPARγ，在引发DKD纤维化发展的关键因子形成的瀑布式反应中发挥始动作用。高糖环境下，miR-27a表达水平增高，miR-27a通过直接靶向PPARγ mRNA的3′-UTR使其磷酸化，抑制PPARγ水平，进而激活TGF-β1/Smad3信号通路。TGF-β1/Smad3信号通路的激活一方面能促进CTGF的表达以及EMT；另一方面能使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，上调成纤维细胞中基质基因(如纤粘连蛋白及Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白等)的表达，共同促进肾组织纤维化，加快DKD的进展。研究表明PPARγ激动剂(罗格列酮)能通过miR-27a/PPARγ/TGF-β1/Smad3轴对DKD进展有确切的延缓作用，但具体相关机制尚不明确[30]。

2 miR-27a与内质网应激及相关肾脏结构损伤

miR-27a上调能诱导DKD中内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和相应足细胞损伤。叉头状转录因子O1(forkhead transcription factor O1,FoxO1)是miR-27a引发DKD中ERS及足细胞损伤的靶基因，miR-27a能与FoxO1 mRNA的3′-UTR结合，通过负向调节作用使其表达水平下调[31-33]，从而影响细胞增殖[31,34]，与足细胞的凋亡有关。该过程能被miR-27a的竞争性内源性RNA——长基因间非编码RNA1619调节，即在高糖环境下长基因间非编码RNA1619表达水平下降促进了miR-27a对FoxO1的抑制作用，继而引起ERS及相关足细胞损伤[35]。

FoxO1是Fox基因家族中的O亚族。FoxO1能够参与调控细胞的自噬、增殖与分化、胰岛素的合成和调节线粒体功能等多种细胞进程。FoxO1可通过调节线粒体自噬、减少氧化应激产物的过度释放而改善糖尿病足细胞的氧化应激损伤[36-37]。miR-27a能使FoxO1的表达水平下降，促进DKD中足细胞的氧化应激损伤，引发ERS。

内质网对细胞稳态的维持、发育和应激反应至关重要，是蛋白质、糖、脂合成、加工、代谢的主要场所。内质网易受各种刺激(如氧化应激、炎症反应、营养缺乏等)影响导致其功能紊乱，蛋白合成代谢速率下降，大量未折叠或错误折叠蛋白蓄积于内质网腔，继而诱发ERS[38-39]。ERS根据发生机制可分为因未折叠或错误折叠蛋白蓄积于内质网腔诱发的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)、正确折叠蛋白质在内质网内过度蓄积引发的内质网超负荷反应及胆固醇缺乏诱发的固醇调节级联反应[40]。DKD中存在高血糖环境、氧化应激、肾素-血管紧张素系统激活、脂质代谢障碍等多种ERS的诱发因素，如DKD患者体内糖基化终末产物、非酯化脂肪酸、高级氧化蛋白产物蓄积可引起UPR。适度的UPR可以通过自噬等协调作用减轻蛋白质错误折叠及其后果，有利于细胞内环境稳态的维持和恢复，而严重持久的UPR引起非适应性ERS会激发促凋亡信号，如C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、Tribbles同源蛋白3、c-Jun氨基端激酶、caspase-12等，使细胞损伤，最终发生凋亡[41-43]，熊去氧胆酸、4-苯基丁酸等可通过下调ERS相关蛋白(内切型X盒结合蛋白1、CHOP、caspase-12)的表达，以及改善血糖水平及胰岛素抵抗发挥逆转系膜扩展、调节肾脏细胞自噬、抑制凋亡等作用，可为DKD的治疗提供依据[43]。内质网应激相关机制可导致肾脏足细胞、系膜细胞、内皮细胞损伤，加快DKD进程。

2.1ERS相关足细胞损伤 足细胞附着于肾小球基膜，需要消耗大量能量以维持正常生理功能，加之其内质网有较强的蛋白折叠能力及合成、分解代谢活跃，因此对于氧化应激非常敏感，易受ERS影响[41]。DKD患者体内存在的高糖环境可使miR-27a表达水平上调，促进诱导产生活性氧类，同时结合代谢异常所致非酯化脂肪酸在内质网腔异常蓄积，引发足细胞UPR，促进足细胞凋亡，加重DKD进程。

研究表明FoxO1能减轻糖尿病大鼠中高糖诱导的足细胞损伤，能使其抗氧化基因的表达上调，从而促进活性氧类的清除能力，抑制UPR及相应足细胞损伤及凋亡[44-45]。有研究表明，将FoxO1基因转染于DKD小鼠足细胞，并通过抑制磷酸化提高其转录活性后，足细胞标志蛋白nephrin有所回升，而原先增多的间质标志蛋白水平下降，说明FoxO1可延缓甚至一定程度上逆转EMT的发生，缓解糖尿病肾脏病变[46]。miR-27a作为FoxO1的上游调控基因，可能通过这一途径对DKD进程产生影响。

2.2肾小球系膜细胞损伤 系膜细胞能调节肾小球的滤过作用、吞噬凋亡细胞、维持系膜基质稳态等，系膜细胞损伤是DKD进程的重要环节。高糖下miR-27a诱导产生的活性氧类瀑式反应、糖基化终末产物、高级氧化蛋白产物、脂肪酸结合蛋白4增加等都易诱导系膜细胞发生ERS，从而导致系膜细胞增殖、ECM过度生成等，共同促进DKD进展[41]。糖基化终末产物可通过晚期糖基化终末产物受体/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路诱导系膜细胞自噬，在一定程度上对系膜细胞因糖基化终末产物引起的凋亡起保护作用。而ERS对该过程具有上游调控作用，从而促进其增殖、分泌细胞因子和系膜外基质产生增多[42]，甚至可以通过ERS的CHOP途径导致细胞坏死[47]。

2.3肾小球内皮细胞及小管损伤 内皮细胞损伤是糖尿病血管病变的中心事件，高糖诱导的ERS与内皮细胞功能障碍关系密切。研究表明肾小球内皮细胞经高级氧化蛋白产物处理后，内皮细胞标志性分子(上皮钙黏素、CD31、Claudin-5)表达水平下调，而间充质细胞标志分子(波形蛋白、成纤维细胞特异蛋白)过表达，高级氧化蛋白产物可通过双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶/CHOP途径诱发ERS引发内皮-肌成纤维细胞转化，促血管生成素1可通过该途径抑制肾小球内皮细胞功能障碍[41,48]。小管上皮细胞与小管间质细胞极易受高糖诱导的代谢紊乱影响，导致其损伤。小管间质中ERS相关基因表达上调，表明ERS参与肾小管EMT过程[49]。

3 小 结

目前关于miR-27a与DKD间的各方面作用机制研究还未完全明确。许多研究表明糖尿病高糖环境下miR-27a表达水平上调，能通过抑制PPARγ、FoxO1等激活相关信号通路以及通过诱导ERS导致肾脏的结构及功能改变引起肾功能恶化，加重DKD，增进其向终末期肾病发展的进程。同时，在相关病理生理机制的研究过程中，也提供PPARγ激动剂(罗格列酮)、熊去氧胆酸、4-苯基丁酸等DKD的治疗靶点。未来深入研究miR-27a对DKD作用的相关机制，有望为针对DKD的治疗提供新的更加有效的诊断、监测及治疗策略。