中药现场鉴定技术研究进展

胡晓宇，杨馨玥，姚金剑，陈雪，都景晓，辛杰，张波，陈敏

(临沂大学药学院,山东 临沂 276000)

近年来，国家高度重视中医药产业发展，中医药事业迎来了“天时、地利、人和”的最好发展机遇，中医药产业总值屡创新高。中药材是中医药产业立足和发展的物质基础，药材的真实性和优良品质是保障中药产业可持续发展的根基。中药鉴定的核心任务即是鉴定中药的“真伪优劣”，因此中药鉴定在整个中药产业的生产、销售及开发利用过程中发挥着举足轻重的作用。

近20年，随着现代科学技术的不断发展及多学科的交叉融合，中药鉴定技术也进入了快速发展时期，鉴定手段不断丰富，鉴定结果的客观性和准确性也不断提高。陈士林等[1]总结分析了中药鉴定新技术的原理、特点及发展方向，包括显微鉴定新技术、光谱鉴定、色谱鉴定、分子鉴定、生物效益鉴定等等。中药材的生产及流通是整个中药产业的最前端，也是最需要中药鉴定技术的环节。然而现有中药鉴定技术大多只停留在实验室研究阶段，在药材生产实际、贸易流通环节的现场化应用不足，即缺乏中药现场鉴定技术。

中药现场鉴定技术，即适用于中药种植基地的田间地头、中药流通领域的药材市场和药店等场所的中药鉴定技术的总称。根据其应用对象及目的不同，大致可以分为两个层次：一是药材监督检测部门，对检测结果准确性和客观性要求较高，且有条件携带部分简单的车载仪器供现场鉴定使用的鉴定技术；二是药材生产及消费者，对检测结果要求直观可见，容易判断，检测过程简便高效，且基本不依赖任何仪器设备的鉴定方法。因此，对于中药现场鉴定技术而言，其技术特点要求：①不依赖仪器设备，或仅需要少量小型便携式仪器；②检测结果越直观越好；③检测时间短，尽量控制在1 h以内；④操作简单，简便易学；⑤尽量减少有毒试剂或有机试剂的用量；⑥检测成本低。

鉴于目前尚没有专门针对中药现场鉴定技术的概述且以现场鉴定为出发点的鉴定研究较少，为充分发挥中药鉴定技术在生产及贸易实践中鉴别中药真伪优劣的重要作用，作者筛选了可用于现场鉴定的技术方法，介绍了方法的可行性、适用范围及优缺点，亦为中药现场鉴定技术的研究开发提供参考。

1 经验鉴别

经验鉴别主要是指鉴定人凭借对中药材的眼观、口尝、鼻闻、手摸等多种感觉并结合“水试”、“火试”或其他“试剂反应”产生的特殊实验现象，给予药材直观的评价，辨别药材真伪。经验鉴别在中药房及药库等场所应用极其广泛，且十分高效。陆丽元[2]介绍了经验鉴别法在基层中药库中的主要应用，总结了不同药材通过眼观、口尝、鼻闻、手摸、水试、火试等手段达到真伪鉴别的具体方法。经验鉴别具体又可分为性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别等部分。

1.1 性状鉴别 性状鉴别是传统四大鉴定技术之一，在中药鉴定技术匮乏的时期发挥着重要作用。时至今日，性状鉴定仍然是生产实际应用最广泛的鉴定技术，尤其是在条件有限的基层。性状鉴别多用于性状没有发生较大变化的药材，如生药和中药饮片。王文骊[3]详细介绍了酸枣仁、黄精、没药、附子、金钱草等10余种正品中药材及其常用伪品的性状差异，用以鉴别真伪，确保临床用药安全有效。性状鉴别是最基本也是十分高级的鉴定技术之一。“最基本”在于多数鉴定人根据药材的性状描述即可进行简单的初判，而“高级”之处在于如今能够真正熟练或是精通此项技术的人才实属凤毛麟角，且要练就一番“火眼金睛”需要大量的实践与积累。性状鉴别应用于现场鉴定的优势包括：无须仪器设备、鉴定快速、不损坏药材、方法适用性较广、可辨真伪亦可判优劣等等。其局限性在于鉴定结果受鉴定人主观因素影响较大，中药种类浩繁导致鉴定人能力有限，且人才短缺严重。

1.2 显微鉴别 中药显微鉴定技术主要是指利用各种显微镜对中药的组织、细胞及细胞内含物的形态特征进行观察分析，用以评价中药质量的方法。显微鉴定适用性较广，尤其是对于缺乏性状鉴别依据的中药材及中成药粉末。中药显微鉴定技术应用于现场化的主要优势在于所需仪器设备简单(光学显微镜可用放大镜代替；粉碎机亦可用手持式研磨装置代替)、速度快、取样量少、实用且环保。王珺等[4]详细介绍了中药显微鉴别技术的发展历史及其在中药组织鉴别、粉末鉴别、显微定量等方面的应用。

1.3 理化鉴别 理化鉴别主要包括水试法、火试法和部分“显色反应”，水试法是根据某些中药材在水中或遇水后产生明显而特殊的反应，用以鉴别药材；火试法是指通过观察中药材经火燃烧或烘焙后产生的气味、颜色、烟雾、声响、膨胀、熔融及燃烧程度等变化现象，以鉴别药材的方法。王裴芳等[5]采用水试法用以鉴别西红花掺伪红花、菟丝子参杂质、乳香掺杂人工伪品；利用火试法鉴别海金沙、檀香、苏木、血余炭、青黛、降香等药材掺杂伪品，效果良好。王秀珠[6]以特殊显色反应为主要鉴别手段，概况总结了35种有毒中药的理化鉴别方法，如“川乌乙醇提取物，加醋酸溶解后遇碘化汞钾显黄色沉淀；山豆根外皮遇氢氧化钠颜色由橙红变血红，经久不退”等等。理化鉴别操作简单且对于检测条件无要求，是中药现场鉴定的有效方法。

2 薄层色谱及其联用技术

薄层色谱(TLC)是一种较早应用于中药鉴定的方法，在我国历版药典中均有大量应用。TLC以中药化学对照品、对照药材或其提取物为参照，进行特定的显色反应来进行药材的真伪鉴定[7]。TLC操作简便、检测时间短、色谱结果直观、检测成本低廉、无须昂贵实验仪器等技术特点均符合中药现场鉴定技术的要求。TLC仅需配以小型提取装置及手持式紫外灯即可现场运用。TLC适用性广，对于动植物、矿物药材、中药提取物、中成药等均可使用，但TLC仅可进行药材真伪鉴定，缺乏品质优劣的鉴定能力，且需要对照品或对照药材，对未知药材无法鉴定。TLC在中药现场鉴定技术开发中具有一定的优势，如若针对不同药物开发出相应的检测试剂盒将会进一步提高TLC的现场化应用。

TLC用于中药鉴定仍需要对照品或对照药材，为解决这一问题，可将TLC与其他定性鉴别仪器联用，从而实现中药的真伪鉴定。陈艳琼等[8]将TLC与表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)联用实现了中药黄连的快速鉴别，其首先分别扫描了盐酸小檗碱对照品的常规拉曼光谱(Raman spectroscopy，RS)、黄连TLC小檗碱斑点的RS及其SERS，然后将黄连TLC斑点的SERS与盐酸小檗碱对照品的RS进行对比分析。最终，通过扣除空白对照后，TLC中小檗碱成分的SERS与对照品的RS的光谱特征一致。因此，黄连的鉴别可直接将其SERS与小檗碱对照RS进行比对，而不再需要小檗碱对照品，从而实现了黄连的无标化快速检测。

3 光谱鉴别技术

近年来，光谱鉴别技术如近红外光谱(near infrared reflectance spectroscopy，NIR)、RS在中药鉴定中的应用逐渐增多。光谱鉴别的主要优势在于简便高效、快速无损。尤其是便携式近红外光谱仪和便携式拉曼光谱仪的研发应用，为NIR和RS技术应用于中药现场化鉴定提供了强有力的工具。

3.1 NIR NIR是指介于中红外光谱与可见光之间的电磁波，其谱区范围为780～2 526 nm之间。NIR运用于中药现场鉴定的主要方式是通过便携式近红外光谱仪对药材进行扫描并收集信号，然后通过主成分分析法、簇类独立软模式法、支持向量机法、偏最小二乘判别分析等不同算法进行信号处理，从而实现药材的鉴别。江明珠等[9]利用便携式近红外光谱仪对霍山石斛枫斗和河南石斛枫斗进行光谱采集，采用一阶导数+标准正态变量变换+均值中心化的信号预处理方法，然后运用偏最小二乘判别分析建立了快速无损鉴别石斛的数理模型，实现了231个石斛枫斗的快速无损鉴别且正确率100%。NIR适用于中药品种鉴别、产地鉴别以及中药质量评价等。

3.2 RS RS是一种散射光谱，其定性定量分析是基于拉曼效应原理。便携式拉曼光谱仪是针对大型拉曼仪的激光器、探头及光谱仪等部位进行小型化设计，从而使其在保证分辨率和灵敏度的同时兼具体小质轻、便于携带的优点。RS适用于中药材的鉴别、中药成分分析及中药质量控制。黄秀丽等[10]利用便携式激光拉曼光谱仪对灵芝孢子油和其他5种植物油进行光谱扫描，然后依据图谱1 115 cm-1峰强度大于350和1 300 cm-1/1 262 cm-1峰强度比值及峰面积比值均大于2的特征，建立了现场化灵芝孢子油掺伪的快速鉴别方法。

4 分子鉴定

中药分子鉴定是中药学与分子生物学的有机结合，通过20多年的发展，如今已然成为中药鉴定领域的焦点，且获得了多项重要成果，如《中国药典》2010年版首次收录了特定引物PCR标记技术鉴定蕲蛇和乌梢蛇，《中国药典》2015年版收载了DNA条形码技术指导原则、诞生并发展了一门新兴学科——《分子生药学》等等[11-12]。中药分子鉴定以中药遗传物质的差异性来进行鉴别，不受药材外观性状的影响，样品用量少，检测结果准确。该技术对于能够提取到足量DNA的中药均可使用，在多基源药用动植物鉴定、濒危珍贵动植物药材鉴定、药材掺伪鉴定、含生药原形的中成药鉴定、药材生长年限鉴定、产地鉴定等方面具有十分突出的技术优势，解决了传统鉴别中的诸多难点问题[13]。

中药分子鉴定传统方法通常先利用CTAB法或SDS法提取药材DNA，然后利用PCR仪进行扩增及凝胶成像检测或进行基因测序。整个鉴定过程步骤烦琐、耗时长，且对仪器、实验条件、操作人员技术水平均有较高要求，导致无法应用于现场快速检测。为解决以上问题，袁媛等[14]通过技术创新与模式创新建立了中药材分子鉴别现场运用策略。其首先建立了一种基于碱裂解法的中药材DNA快速提取方法，并成功开发了试剂盒，极大程度的缩短了DNA提取时间，简化了操作流程，且提取效果良好(果实、种子、全草、花类、皮类、根类药材及炮制品，DNA提取成功率在85%以上)；其次以金银花为例，改良了一种基于单核苷酸多态性(SNP)标记的LAMP技术，通过在反应底物中加入SYBR Green染料，紫外灯下检测有无荧光即可鉴定药材真伪。

按照整个规程操作，实现药材的现场鉴定时间可控制在1 h以内，过程中仅需要手持式研磨仪、微型金属加热槽、手持式紫外灯等简单装置，且操作简便易行、检测成本低。此套鉴定技术体系为中药分子鉴定的现场运用提供了有力借鉴，且比较适用于药监部门的飞行检测。

5 免疫层析技术

免疫层析技术是将基于抗原与抗体特异性免疫反应与纸色谱技术原理相结合的一种定性定量检测技术。其以纤维层析材料为固定相，在毛细作用下将样品中的待检测物质迁移至抗原或抗体固定区域，然后通过不同标记物的显色反应进行结果判定。其适用于现场化检测的最主要的优势在于检测结果比较直观，不需要或仅需一至两个小型仪器，且检测时间短(通常在10 min以内)。根据标记物的不同，现有已应用于中药免疫层析鉴定中的免疫层析技术主要包括胶体金免疫层析技术(colloidal gold immunochromatograohic assay，GICA)和荧光标记免疫层析技术(fluorescent immunochromatographic assay，FICA)。

5.1 胶体金免疫层析技术鉴定 GICA是以胶体金颗粒为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型固相免疫标记技术。该技术自1990年诞生至今，已在医学检验、食品安全检测、环境监测等领域广泛应用，直至近10年才被中药学者应用于中药鉴定研究领域，涉及中药质量评价、中药安全性评价等[15-17]。胶体金是一种自带红色的金颗粒，其检测结果直观可见，无须仪器设备，再者GICA检测时间通常不超过10 min，操作亦十分简单，因此GICA非常适用于现场检测。此外，由于GICA是基于抗原与抗体的特异性识别而实现的定性检测，因此具有较高的方法特异性，且灵敏度较高，通常在pg-ng级别。

GICA可实现中药指标性成分的半定量检测，因此其主要用于中药质量的优劣评价(以颜色深浅鉴别)或基于药典标准的中药质量合格性评价(以颜色有无鉴别)。

甘草酸是《中国药典》中规定的甘草指标性成分之一，Zhao等[18]建立了甘草酸的GICA检测方法，该试纸灵敏度为20～50 ng·mL-1，检测时间为10 min，通过自来水浸提不同甘草组织部位30 min后，该试纸可有效鉴别甘草根、茎、叶中甘草酸含量高低。南铁贵等[19]以特异性识别人参皂苷Re的单克隆抗体为原料，建立了人参皂苷Re的GICA检测方法(检测限为200 ng·mL-1)，通过自来水浸提人参样品30 min，上清用GICA试纸检测，10 min即可鉴别不同年限人参药材中人参皂苷Re的含量多寡，可作为人参质量优劣评价的重要依据。整个检测过程均不需要仪器设备，且检测时间短，操作简便，完全适用于现场化操作。

张波等[20]以《中国药典》规定的金银花指标性成分绿原酸和木犀草苷为研究对象，制备了两者的特异性单克隆抗体，通过胶体金标记抗体后分别制备了检测绿原酸和木犀草苷的胶体金免疫检测试纸，按照药典标准方法提取绿原酸和木犀草苷，根据药典中两者的含量限定要求分别稀释至相应倍数后，以试纸条检测，通过试纸条检测线的颜色有无即可鉴定样品中绿原酸和木犀草苷含量是否满足药典要求，从而实现了金银花指标性成分含量合格性的快速测定，整个从提取到检测的过程不超过1 h，且过程中仅用到了超声清洗仪一台仪器。

此外，现已有柚皮苷[21]、柴胡皂苷D[22]、番泻苷A和番泻苷B[23]、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1[24]、桑皮苷A[25]、积雪草苷[26]、淫羊藿苷[27]等多种中药质量控制指标性成分的胶体金快速检测试纸研制成功，为这些中药材的质量现场化评价提供了有力工具。

GICA在中药真伪鉴定方面的应用较少，其主要原因在于可直接用于区别药材的指标性成分极少。中药种类浩繁，且同科属多种药用植物均可入药，在化学成分层面上很难找出某个药材特有而其他药材没有的专属性物质，此外该物质还需有一定的含量以便于提取检测。寻找和发现此类中药真伪鉴定指标性成分，再结合现有的质量评价指标性成分，即可利用GICA技术建立药材真伪优劣同步鉴定的现场化检测方法。例如，土大黄苷是伪品大黄区别于正品大黄的真伪鉴定指标性成分，同时蒽醌类成分是大黄的质量评价指标性成分，因此，通过建立检测两类成分的GICA检测方法，并简化提取工艺，即可建立大黄的真伪优劣同步快速、现场化鉴定方法，从而便于大黄质量的现场化检测，便利大黄贸易交流。

5.2 荧光标记免疫层析技术 除以胶体金为标记物的免疫层析技术以外，荧光标记物如荧光微球和量子点等也广泛应用于免疫层析试纸[28]，但与胶体金试纸相比，荧光标记物需要紫外灯检测结果且荧光强度衰减较快，稳定性及便利性略差。Qu等[29]利用量子点标记了可特异性识别葛根素的单克隆抗体，并制备了免疫层析试纸，通过试纸条阅读器实现了葛根素的定量检测，其检测范围为1～10 μg·mL-1。同理，Zhang等[30]将量子点标记于特异性识别大黄酸的鸡卵黄抗体上，并制备了免疫层析试纸，该试纸灵敏度为98.2 ng·mL-1。

6 适配体层析技术

核酸适配体(aptamer)是一种通过指数富集配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选获得的一段寡核苷酸序列(RNA或DNA)，其能够折叠成一定的空间结构与靶标物质特异性吸附。适配体功能与抗体相似，但由于其可通过动物体外化学合成，又被称为“化学抗体”。此外，适配体还具有分子量小、易于标记、稳定性好、无批间差异等优势，目前已广泛应用于临床医疗、生化分析、食品安全等领域[31-33]。适配体层析技术原理与免疫层析技术相似，仅是以适配体取代了免疫层析中抗体的作用，该技术适用于中药现场鉴定的原理与优势亦与免疫层析相同。目前适配体层析技术主要用于中药安全性评价研究，如Zhou等[34]筛选了赭曲霉毒素的适配体，并以胶体金为标记物制备了适配体层析试纸，将其应用于中药黄芪的赭曲霉毒素现场快速筛查，检测结果与液质联用检测结果相同。虽然目前针对中药指标性成分的适配体层析试纸研究还鲜有报道，但其自身的诸多优势表明其在中药现场鉴定方面具有较广阔的发展前景。

7 总结与展望

中药现场鉴定技术是中药鉴定技术在生产实际和中药流通领域的现场化运用，是实现中药鉴定技术成果转化的主要方向之一，中药鉴定技术现场化运用以后亦将大大推动中药产业的发展。

现有中药现场鉴定技术如经验鉴别、薄层色谱鉴别、近红外和拉曼光谱鉴别、分子鉴定在中药真伪鉴定应用较多，且技术优势较明显，未来应进一步针对现场化应用的目标加强技术优化和技术适用范围的扩大。而针对中药品质优劣的现场鉴定技术(如免疫层析技术、适配体层析技术)虽然在检测环节可以做到简单快速，但在中药指标性成分的快速提取方面还有待更深入的研究，诸多难题仍需克服，包括：①如何改进提取方式？药典中的指标性成分提取方式以超声提取和加热回流提取为主，且部分药材还需要提前浸渍或萃取或酸水解处理，提取时间往往在30 min至3 h之间，如何缩短提取时间，简化步骤，且保证提取效率?近年来发展的闪士提取和酶辅助提取方法可供参考。②如何标准化？提取方法和检测方法改变以后，需要制定一套适用于现场化应用的提取、检测、评价的标准体系以便于与《中国药典》中的标准实现等效。