血清雌三醇的检测技术及临床应用

彭絮，邹迎曙，王军（通信作者）

北京市医疗器械检验所 （北京 101111）

血清雌三醇（estriol，E3）是由人类胎盘产生的一种甾体雌激素，属于雌酮和雌二醇的代谢产物[1]。近年来的研究表明，母体血清中雌三醇的水平与胎盘存在密切关系，可以有效监测胎盘功能与胎儿发育情况[2]。孕妇血清中雌三醇的水平与唐氏综合征、妊娠高血压综合征等均有着密切关系，快速准确地检测血清雌三醇有重要的临床参考价值。

血清雌三醇的检测可为临床干预提供可靠依据，但由于激素类物质在血液中含量极低，浓度为pmol水平，是临床实验室检测的难题。样本的前处理方式，检测仪器的准确度及精密度，自动化流程等问题都限制了其在临床应用方面的发展。现介绍目前临床实验室血清雌三醇的各种检测技术及相应的临床应用。

1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用酶标记的抗原分子抗体分子反应，使游离的杂蛋白与结合在固相载体上的目的蛋白分离，并利用产物的颜色深浅来定性或定量的一种分析检测方法。ELISA属于竞争性固相酶免疫检测法，该方法在临床上已被广泛应用，但由于方法本身存在的缺陷以及操作过程对试验的检测结果影响较大，都会造成试验性误诊、漏诊的发生[3]。试剂的质量，检测的标本，操作技术，内源性物质均会影响ELISA检测的准确度。乔娜等[4]通过采用ELISA检测1 912例孕妇早期血清未结合雌三醇水平等相关指标，绘制受试者的工作特征曲线评价雌三醇单个指标与联合指标以预测孕期子痫前期的价值，结果显示，孕中期子痫前期组血清未结合雌三醇水平低于正常组（P＜0.05），孕中期轻度子痫前期组血清未结合雌三醇水平与重度子痫前期组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。子痫前期是妊娠期的特发疾病，未结合雌三醇水平对子痫前期有一定的预测价值。

2 放射免疫测定法

放射免疫测定法（radioimmunoassav，RIA）是将免疫反应与放射性核素测量相结合，根据射线的多少定性或定量的一种检测方法，也称为竞争性饱和分析法。吴丹凝等[5]在传统的RIA基础上，以磁微粒为二抗分离剂建立了两种测定血清雌三醇的分析方法，结果表明，测定血清雌三醇线性范围为0.3～30.0 μg/L，批内与批间相对偏差最大为4.4%和8.7%，两种方法反应时间短，灵敏度好，其精密度与准确度均满足临床试验的要求。洪建琴等[6]用RIA测定679例妊娠中晚期孕妇血清雌三醇和甘氨胆酸，发现正常妊娠孕妇血清雌三醇随孕周增加而增加，而异常妊娠孕妇在孕32周后雌三醇会明显降低，过期妊娠孕妇在孕40周前雌三醇在正常孕周下限，40周后会明显下降，而血清雌三醇会随着妊娠高血压症状越严重下降程度越快。总之，RIA简便易行，血样本用量少，但会用到放射性物质，且有时会出现假阳性反应。

3 时间分辨荧光免疫分析法

时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是用时间分辨技术测量荧光的一种非放射性的微量分析检测方法，TRFIA将非特异性荧光干扰有效地排除，从而可提高检测结果的灵敏度，已成为临床常用的分析检测方法之一，逐渐代替了RIA。汪国庆等[7]利用TRFIA发现游离雌三醇的测定结果由于乳糜样外观脂血的程度（轻度、中度与高度脂血）不同而不同，对TRFIA测定血清游离雌三醇存在不同的干扰，从而影响唐氏筛查结果的准确度。因此，在临床唐氏综合征产前筛查前，应采集孕妇空腹血清。孙茜等[8]对140例通过辅助生育技术受孕的孕妇和420例孕周等相匹配的自然妊娠孕妇进行比较，用TRFIA进行血清雌三醇等指标的三联筛查，结果表明，通过辅助生育技术妊娠可能会引起各标记物的中位数与中位数倍数（MoM）值的差异，可提高产前筛查的检出率。

4 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）广泛应用于激素、酶、抗体、抗原、维生素等的测量，是将化学发光测定技术与免疫反应相结合的一种分析检测方法，检测结果灵敏度较高[9]。全自动化学发光仪的应用使得CLIA比ELISA测定血清雌三醇步骤简单，测量范围宽，测定速度快，是目前临床测定血清雌三醇的常规方法，但以抗原抗体反应为基础会带来非特异性反应，从而使得各实验室不同厂家生产的试剂盒检测结果的可比性差[10]。唐静和饶欢欢[11]采用CLIA测定孕妇怀孕中期血清中游离雌三醇等指标浓度，数据表明，CLIA测定高龄孕妇唐氏筛查阳性率为10.87%，适龄对照组为3.33%，而高通量基因测序产前筛查阳性率为6.52%，说明CLIA可缩小高通量基因测序产前筛查的范围，对怀有唐氏儿的孕妇不会产生遗漏，又可减少孕检的相关费用。郑雪玲[12]采用CLIA对100例先兆流产孕妇和40例正常孕妇体内血清雌三醇及其他相关指标水平进行检测，联合诊断先兆流产的准确性，结果显示，先兆流产继续妊娠组和正常组的血清雌三醇与绒毛膜促性腺激素水平明显高于先兆流产妊娠失败组，联合检测血清雌三醇水平及相关指标水平可作为预测先兆流产妊娠结局的重要指标。

5 气相色谱质谱联用法

气相色谱质谱联用法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）是通过氮气等惰性气体为载气将目标分析样品载入色谱柱上的固定相，目标分析样品在气固两相中的分配系数不同而分离程度不同，再经离子源离子化后达到质荷比分离，测定各离子谱峰的强度从而实现定量分析的目的。国际检验医学溯源联合会（JCTLM）的列表中测定血清雌三醇的参考方法是同位素稀释气相色谱质谱联用法（IDGC/MS），GC-MS检测灵敏度较高，但该方法需要衍生化，由于衍生反应操作步骤较复杂，会引入新的误差从而增加测量不确定度，衍生反应的条件要求也非常严格，对试验人员要求高，衍生过程用时较长，目标分析物的质谱运行时间长，需要的血清样本量较大，不利于临床实验室推广。

6 液相色谱质谱联用法

液相色谱质谱联用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）是将目标分析样品溶液被流动相载入色谱柱内，由于目标分析样品溶液中各组分在液固两相间的分配系数不同而在色谱柱上的移动速度不同，被分离的单个组分分别从色谱柱中流出后在质谱离子源内发生电离反应，样品离子化后变为气态离子，生成荷质比不同的带电离子，带电离子经过加速电场后形成离子束被加速进入质量分析器，不同的离子在质量分析器中由于质荷比大小不同而被分离并依次抵达检测器，得到质谱谱峰图从而定性或定量。LC-MS较GC-MS分析检测的速度快，效率高。

赵昂等[13]采用LC-MS/MS检测人血清中雌三醇等微量物质，经过两步液液萃取后通过丹磺酰氯进行衍生反应后进行进行样品分析，在多反应监测模式（MRM）下，可以提高离子化效率，最终血清中雌三醇测定结果精密度最大为6.42%，定量下限为10 ng/L，线性范围为0.01～5.00 μg/L。LC-MS/MS的灵敏度较高，适用于人体血清中游离雌三醇的分析检测。但方法需进行衍生化操作，在此基础上，郑松柏等[14-15]对前处理方法、色谱条件和质谱条件分别进行了优化，省略了衍生化步骤，建立了同位素稀释液相色谱串联质谱法（ID-LC/MS/MS），得到了较好的结果。建立的方法分别对流动相缓冲盐、流动相梯度、样品进样量、萃取溶剂及萃取比例进行了优化与研究，最终检测结果的线性范围为0.4～20.0 ng/ml，精密度最大为2.04%。建立的方法特异性好，11种结构类似物对雌三醇定量检测均无干扰，方法的携带污染率低。

综上所述，血清雌三醇水平的准确测定在孕期的产前筛查等方面可为临床提供有价值的数据参考，而各检测技术都有其特点，在结果重复性、操作简易性、测量范围等方面均有其优缺点，但随着血清雌三醇检测技术的不断发展进步，精密度好、灵敏度高、自动化程度高、可为临床医师提供快速准确检测结果的检测技术将有很好的临床应用前景。