补肾活血方对抗心磷脂抗体（+）复发性流产患者蜕膜及外周血膜联蛋白A2和Toll样受体4的影响研究

冯晓玲，常卓，张璇，陈璐，王炜，赵小萱，赵颜

复发性流产（RSA）是指育龄期妇女与同一性伴侣，连续发生自然流产的次数≥2次的一种妊娠疾病。育龄期妇女RSA发生率约为1%［1］，是一种常见的妇科疑难杂病。尽管对于RSA的病因尚未完全明确，但大多数学者认为免疫因素是重要致病因素，其中抗心磷脂抗体（ACA）（+）是已知的和RSA相关的免疫因素，其通过影响凝血状态、血栓形成从而可能导致RSA［2-5］。近年来研究表明，RSA发生率与ACA阳性率呈显著正相关，其可能通过影响凝血状态、胎盘血管、前列环素/血栓素A2、子宫内膜容受性等进而影响妊娠过程［6］。所以以ACA为靶点一直是相关研究的关注点［7］。西医学对ACA（+）RSA的治疗主要集中在抗血栓形成和免疫抑制等方面，常采用阿司匹林、泼尼松以及低分子肝素等抗凝类药物进行治疗［8］。而祖国医学则认为ACA（+）RSA属于滑胎之肾虚血瘀证，并对症予以补肾活血法，以补肾为本，活血治标进行标本同治，瘀血祛则胎安、肾气充则胎固，共奏安胎之效。如《内经》中“四乌贼骨——藘茹丸”，是补肾活血法方药的先河，张锡纯“肾气丸为补肾之药，实兼为化淤血之药”的理论，也提出了补肾活血的安胎原则［9］。本研究是在前期补肾活血方治疗ACA（+）RSA的经验［10］基础上进行的机制研究。本课题组前期研究发现，ACA（+）RSA的发生与Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）炎性通路及其因子有着密切关系［11］，所以本研究探讨补肾活血方对TLR4/NF-κB炎性通路上的因子〔膜联蛋白A2（ANXA2），TLR4〕及评估妊娠结局的指标的调节作用，进而阐述其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 选取2015年3月—2016年3月在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊及住院部治疗的符合纳入标准的ACA（+）RSA现妊娠失败需行清宫术患者16例，在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊行正常人工流产者15例，共收集蜕膜样本31例：ACA（+）RSA者蜕膜为试验组1（n=16）、正常人工流产者蜕膜为对照组1（n=15），其中试验组1中1例因流产组织发现染色体异常故予以排除。两组年龄、妊娠时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。纳入标准：（1）年龄22～42岁。（2）妊娠12周以内。（3）试验组1患者符合ACA（+）RSA西医诊断标准及肾虚血瘀型RSA中医诊断标准的妊娠失败患者。根据第8版《妇产科学》［12］修改制定ACA（+）RSA西医诊断标准：①病史及症状：停经12周内，出现阴道少量流血，或伴有腰酸、腹痛等症状。②妊娠试验：血、尿妊娠试验阳性。③妇科检查：宫颈口未开，宫体软，子宫大小与停经周数相符。④超声检查：子宫大小、孕囊或胚胎发育与妊娠周数基本相符。⑤流产史：连续发生2次或2次以上自然流产。⑥实验室检查：ACA（+）。满足以上6项方可诊断为ACA（+）RSA。根据《中药新药治疗先兆流产的临床研究指导原则》［13］、《中医妇科学》［14］有关内容结合临床修改制定肾虚血瘀型RSA中医诊断标准。主证：孕早期①屡孕屡堕，或如期而堕（堕胎次数≥2次）；②有阴道流血（色暗或夹血块）；③小腹坠痛；④腰酸。次证：①双膝酸软；②头晕耳鸣；③夜尿频多。舌脉：舌紫黯或有瘀点，苔薄白，脉细滑或沉涩。上面主证具备①加另外1项或以上，次证具备1项或以上，结合舌脉即可辨为肾虚血瘀型RSA。（4）对照组1为正常妊娠，无自然流产史，有≥1次正常生育史，实验室检查ACA（-），要求进行人工流产。（5）自愿接受并配合研究者。试验组1排除标准：（1）初诊经过超声诊断或者经过观察后诊断为萄萄胎、异位妊娠等者；（2）夫妻双方或任意一方染色体异常者；（3）超声及妇科检查提示生殖器器质性病变者，如子宫畸形、生殖道畸形、子宫肿瘤等；（4）病毒十项试验提示巨细胞病毒、弓形虫病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒感染者；（5）生殖激素测定提示内分泌异常者；（6）男方精液常规异常者；（7）合并心血管、脑血管、肝肾造血系统等严重原发性疾病，精神病患者；（8）近期服用其他药物，致试验结果难以判断者。脱落标准：入组后，发现胎儿染色体异常等其他病因造成RSA者。

表1 对照组1和试验组1年龄、妊娠时间比较（x±s）Table 1 Comparison of age and days of pregnancy between control group 1 and test group 1

1.1.2 选取2015年3月—2016年3月在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊及住院部治疗的符合研究标准的要求行保胎治疗的ACA（+）RSA患者11例（试验组2），在黑龙江中医药大学附属第一医院门诊行正常孕检者13例（对照组2），收集其血清样本，其中试验组2中1例自然流产，对照组2中3例自动退出，未计入统计数据。两组年龄、妊娠时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。纳入标准：（1）年龄22～42岁；（2）妊娠6～8周；（3）试验组2：符合ACA（+）RSA西医诊断标准及肾虚血瘀型RSA中医诊断标准者（诊断标准参见1.1.1）；（4）对照组2：正常妊娠于本院门诊进行常规产前检查者；（5）自愿接受并配合研究者。排除标准：同1.1.1。脱落标准：（1）入组后，未按规定剂量服用药物或自行停药者；（2）入组后，发现其他造成RSA确切病因者；（3）治疗过程中，自行退出或拒绝治疗后再次采血者。

表2 对照组2和试验组2年龄、妊娠时间比较（x±s）Table 2 Comparison of age and days of pregnancy between control group 2 and test group 2

1.2 主要试剂 DEPC原液（广州市蓝博生物技术有限公司）、TRLZOL Reagents（美国Invitrogen公司）、 无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）、三氯甲烷（天津市博迪化工有限公司）、异丙醇（天津市富宇精细化工有限公司）、dNTP（2.5 mmol/L）〔天根生化科技（北京）有限公司）〕、0.1 mol/L DTT（Beye time公司）、OligodT（美国Thermo Scientific公司）、Taq DNA Polymerase（美国 Thermo Scientific 公司）、5× 反转录酶 Buffer（美国 Thermo Scientific公司）、10×PCR Buffer （美国 Thermo Scientific 公司）、Rnase Inhabitor （美国 Promega 公司）、M- MLV Reverse Transcriptase（美国 Promega公司）、Human ANXA2 ELISA kit试 剂 盒、Human TLR4 ELISA kit试剂盒。

1.3 主要仪器 电子精密天平（Discovery DV215CD）（美国 OHAUS 公司）、NanoPhotometerTMP -Class 超微量紫外分光光度计（德国 Implen公司）、高速组织匀浆器T1000（德国 IKA公司）、涡旋器（德国 IKA公司）、高速冷冻离心机（美国BECKMANCOULTER公司、型号：Alegra 21R）、罗氏RT-qPCR仪（美国Thermo Scientific 公司）、全自动酶标仪（ELX808）（BioTek Instruments.Inc）、DK-8D型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、318W型洗板机（上海三科仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 在冰上提取蜕膜组织RNA，用NanoPhotometerTMP-Class超微量紫外分光光度计测定提取对照组1和试验组1蜕膜组织RNA纯度。记录RNA浓度后将组织样品冻存于-80 ℃冰箱。根据美国 Thermo Scientific公司RT-qPCR试剂盒，严格按照说明书将RNA反转录为cDNA，所得cDNA于-80 ℃保存。然后通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov网站进入Genbank数据库，查找 GAPDH mRNA、 ANXA2 mRNA 以及 TLR4 mRNA 全基因序列，应用上海捷瑞生物工程有限公司设计的引物合成引物序列：ANXA2正向引物为512 3-TGAGCGGGATGCTTTGAAC-312 3，反向引物为 512 3-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-312 3；TLR4正向引物为512 3-TGCAATGGATCAAGGACCAGAGGC-312 3，反向引物为512 3-GTGCTGGGACACCACAACAATCACC-312 3；内参GAPDH正向引物为512 3-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-312 3，反向引物为512 3-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -312 3。最后采用RT-qPCR 法测定 ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA 水平，使用2x SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒，反应体系：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，总共 50 个循环，72℃延伸30 s。经过两步法扩增后得出Ct数值，采用2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达水平。

1.4.2 试验组2从入组留取血清样本后即给予补肾活血方，药物组成：丹参 20 g、菟丝子 15 g、续断 15 g、桑寄生 15 g、阿胶（烊化）15 g、黄芪15 g，根据患者情况随证加减，煎药至300 ml汤剂，早晚分服，治疗4周。以上中药汤剂由黑龙江中医药大学附属第一医院中药局及煎药室提供。对照组2不采取任何干预方法。检测两组患者治疗前及治疗后血清孕酮、β人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）、ANXA2、TLR4水平。

首先将血清样本常温下解冻备用，在酶标板上设置标准品孔5孔，稀释后浓度分别为240、160、80、40、20 μg/L（Human ANXA2 ELISA kit试剂盒），及 18、12、6、3、1.5 ng/ml（Human TLR4 ELISA kit试剂盒），然后加待测样品 10 μl，37 ℃温育30 min；酶标板每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次。然后分别加入50 μl酶标试剂于待测样品孔中，使之混匀，后重复温育、洗涤。加入显色剂 A 50 μl、B 50 μl，混匀、避光。于每孔中加入50 μl终止液，最后于ELX808全自动酶标仪450 nm波长处依序测量各孔OD值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料以（x ±s）表示，两组间比较采用成组t检验，同组治疗前后比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组1和试验组1蜕膜组织中ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA水平比较 对照组1蜕膜组织中ANXA2 mRNA水平高于试验组1，TLR4 mRNA水平低于试验组1，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.2 对照组2和试验组2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比较 治疗前对照组2和试验组2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗后对照组2和试验组2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。试验组2治疗后血清孕酮、β-HCG、ANXA2水平高于治疗前，血清TLR4水平低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

3 讨论

RSA是一种常见的妊娠疾病，不仅给患者自身带来了极大的痛苦和心理压力，也给家庭及社会带来不良影响。近年来的研究发现，ACA（+）是导致RSA的常见因素之一，也成为了研究热点［2-5］。ACA是一种自身免疫性抗体，其可以通过诱导凝血，或影响不同因子损害蜕膜血管内皮细胞，形成血栓倾向，从而使胚胎在发育过程中缺血缺氧，进而导致不良妊娠结局的发生［15］。冯晓玲等［11］研究发现，与正常妊娠者相比，ACA（+）RSA者体内的TLR4/NF-κB炎性通路呈活化状态，其通路上的炎性因子也有相应变化。其中ANXA2和TLR4是该条通路上与血栓、炎症相关的因子，所以本研究基于此背景，收集ACA（+）RSA者和正常妊娠者蜕膜、血清，探讨ANXA2、TLR4在ACA（+）RSA中的表达以及其与该疾病的关系。

本研究结果显示，对照组1蜕膜组织中ANXA2 mRNA水平高于试验组1，TLR4 mRNA水平低于试验组1，试验组2治疗前血清ANXA2水平低于对照组2，TLR4水平高于对照组2。提示这种变化可能与ACA（+）存在相关性，发生机制可以从ANXA2、TLR4与血栓形成倾向、前列腺素合成、炎症、滋养细胞凋亡等角度进行解释。有动物实验证实了ANXA2基因敲除的小鼠不能完全清除损伤后所形成的动脉血栓，证明了其对防止血栓形成的积极作用［16-17］。KIM等［18］研究也证明ANXA2能明显抑制栓塞性脑卒中大鼠模型体内血栓形成。ZHANG等［19］研究发现足月蜕膜感染时，可检测到TLR4表达于炎性细胞表面。PIERANGELI等［20］研究发现，TLR4可诱导滋养细胞凋亡，促进炎性因子和前列腺素分泌，继而导致早产。所以，ACA（+）RSA者蜕膜中ANXA2 mRNA水平降低，TLR4 mRNA水平升高，可引起ACA（+）改变，使蜕膜呈现血栓倾向，从而引发流产。

表3 对照组1和试验组1蜕膜组织中ANXA2 mRNA、TLR4 mRNA水平比较（x ±s）Table 3 Comparison of the expression of ANXA2 mRNA，TLR4 mRNA in decidua tissues between the control group 1 and the test group 1

表4 对照组2和试验组2血清孕酮、β-HCG、ANXA2、TLR4水平比较（x±s）Table 4 Comparison of the expression of progesterone，β-HCG，ANX A2 and TLR4 in blood serum between the control group 2 and the test group 2

ACA（+）RSA与中医滑胎病之肾虚血瘀证的临床表现、致病机制等大致相同［21］。瘀血阻滞冲任，新血不能灌注胞宫，使胞宫不能养胎，致堕胎。数次堕胎耗气伤血，损伤冲任胞宫久病致瘀，瘀血停滞，从而引起反复自然流产的发生。本病血瘀为标，肾虚为本，应用补肾活血之法进行治疗［22-25］。本研究结果显示，ACA（+）RSA者血清中ANXA2水平较治疗前升高，而TLR4水平较治疗前降低。提示补肾活血方有利于维持妊娠，其机制可能是通过调节ANXA2、TLR4。补肾活血方不仅可以在妊娠期间提高激素水平，还可从抗炎、抗凝等分子基础上对ACA（+）RSA进行根本治疗。既往研究表明，补肾活血方可显著提高ACA（+）RSA患者孕酮水平，药物有效率高［26］。补肾活血方以丹参活血调经，养血补血为君药，菟丝子、续断、桑寄生补肾安胎共为臣药，辅以阿胶、黄芪补血益气，共奏补肾活血安胎之功。药理学分析发现，补肾活血方的药物成分可以改善微循环，促进血液流速，降低血液黏度，抑制血小板聚集和凝血功能，对抗血栓形成［27］。亦有研究发现补肾活血类中药可以改善炎性环境，对TLR4/NF-κB炎性通路具有一定调节作用［28］。

综上所述，ACA（+）RSA的发生可能与ANXA2低表达、TLR4高表达相关，补肾活血方可以通过上调ANXA2、下调TLR4抑制ACA（+）RSA患者血清高凝状态，改善炎性环境，进而改善妊娠结局。

作者贡献：冯晓玲、常卓进行文章的构思与设计，撰写论文，对文章整体负责、监督管理；常卓、张璇进行研究的实施与可行性分析；张璇、赵颜进行数据收集；常卓进行数据整理、统计学处理，对结果进行分析与解释；常卓、赵小萱进行论文的中文修订；常卓、王炜进行论文的英文修订；常卓、陈璐、王炜负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。