间断性跪坐缺血预适应方法的探索及应用

叶少剑，袁春平，方 超，关庆宇，卢小颖，江 泓，郑淑园，张 培，成梦凡

（江汉大学 a.医学院；b.体育学院，湖北 武汉 430056）

随着人类生活水平持续改善及平均期望寿命逐渐增加，心脑血管疾病成为了影响老年生活质量的主要原因之一。如何做到预防为主，治未病，是医药卫生工作者研究的方向。缺血预适应在防治心脑血管疾病方面有着很明显的作用。该理论已经被提出30余年，但是由于各种原因至今应用不够广泛。1986年MURRY等[1]发现预先对心脏进行短时间、多次重复的缺血-再灌注后，大大降低了严重缺血后复灌注带来的心肌损伤程度。后来研究发现，对其他器官进行缺血预适应后，对心肌组织也能同时产生保护作用，此现象被称为远程缺血预适应（remote ischemic preconditioning，RIPC）[2]。四肢属于容易进行体外阻断血流的人体结构，所以临床常采用止血带或血压带反复短暂加压阻断上肢或下肢血流进行无创性RIPC[3]。研究表明跪坐姿势可以阻止下肢血液供应[4]，小腿骨骼肌氧含量急剧降低并持续整个跪坐阶段。本研究旨在探索通过合理利用跪坐，建立一种更方便实施的RIPC方法，有利于向大众推广。RIPC可以改善皮肤微循环[5]，本研究观察了应用间断性跪坐法实施RIPC对前臂皮肤毛细血管脆性的影响。

1 实验对象、仪器和方法

经江汉大学医学实验伦理委员会批准，分两批共募集江汉大学医学院2014-2016级本科医学生70人，性别不限，年龄19～21周岁。均为医学院1至3年级本科学生，生活习惯及生活学习环境基本相似。要求膝关节及腿脚无结构及功能障碍，体重、血压、血常规值在正常范围内，无基础性疾病。每位同学可参加实验中的一项或多项。实验过程中因发生疾病或不及时进行检查的学生被排除实验。实验分两个批次进行，最终完成实验者共61人。

1.1 两种缺血再灌注方法对腓肠肌肌氧含量的影响

研究[6]表明手术中反复夹闭病人股动脉进行下肢缺血预适应时其下肢骨骼肌肌氧含量呈现与缺血对应的规律性变化，肌氧含量可以反映肌肉缺血情况。本实验采取体外测试腓肠肌肌氧含量的方法，观察两种无创性阻断腘动脉方法是否会引起其支配的腓肠肌肌氧含量的类似改变。参加者12人，每人以肌氧含量测试仪测量同一部位腓肠肌分别在间断性血压带束缚大腿或间断性跪坐时肌氧含量的变化。为避免反复缺血复灌带来的可能影响导致结果偏差，采取其中6人先测血压带束缚式缺血复灌，另6人先行测试间断跪坐式缺血复灌，一种方式测试结束后休息15 min再进行另一种方式测试。

1.1.1 仪器 美国产ANT+牌MOXY-3型肌氧含量测试仪，使用前充电并调试好日期及时间。使用时固定在受试者待测试肌肉表面的皮肤上，打开电源即开始测试并记录数据。

1.1.2 间断性血压带束缚大腿对腓肠肌肌氧含量的影响 通常实施局部缺血预适应及束缚四肢的远程缺血预适应方案大多是通过阻断动脉5 min后复灌5 min进行短暂缺血再灌注，并重复3～5个回合完成[1-3]。鉴于此，本试验中将血压带绑缚在受试者膝关节上方，快速充气加压至200 mmHg以阻断股动脉并维持5 min，然后放气再灌注5 min，重复3次共30 min。同步记录腓肠肌偏外侧部位的肌氧含量。

1.1.3 间断性跪坐对腓肠肌肌氧含量的影响 跪坐也称正坐（seiza），取跪坐姿势时，脚背和小腿前部与地平面紧贴，膝关节弯曲接近0度，踝关节则绷直成180°，臀部压坐在双侧脚后跟上，上身垂直于地面，重量完全压在小腿上。立起时将膝关节放开成90°或以上即可。试验时采取跪坐5 min，立起5 min的方法，重复3次共30 min。同步记录腓肠肌偏外侧部位的肌氧含量。

1.2 间断性跪坐对前臂皮肤毛细血管脆性及血压的影响

为了初步观察间断性跪坐对人体血管功能的影响，本实验选择了毛细血管脆性这个比较容易观察和实施的可以评价血管功能的指标，初步在大学生群体中进行了观察。受试者随机分成两组，剔除试验期间生病及不能按时完成检查的同学，最终结果对照组27人，实验组34人。

1.2.1 毛细血管脆性实验及改进实验 参照实验诊断学方法，在一侧前臂肘窝下4 cm处画一个直径5 cm的圆圈，观察其中是否有出血点，如有则用记号笔标出。用水银血压表常规测量上臂血压，然后再次给血压带充气，将压力维持在平均动脉压水平8 min后放气解开血压带，等候5 min后计数圆圈内的出血点数量，少于10个出血点为正常。改进毛细血管脆性实验方法同前，只是将血压带维持在平均动脉压的时间由8 min延长到15 min，可在另一侧前臂同时进行。

1.2.2 间断性跪坐对毛细血管脆性的影响 第一次（实验0周）测试毛细血管脆性后，实验组同学按照1.1.3方法每天进行30 min的间断性跪坐缺血预适应练习，于第28天（4周）接受第二次毛细血管脆性测试。对照组同学要求进行间断性跪而不坐练习。两组均有部分同学于两次之间即第二周后接受另一次测试。

1.2.3 间断性跪坐对血压的影响 记录并统计受试者进行毛细血管脆性实验时测得的上臂收缩压、舒张压，比较实验前后血压值的变化。

1.3 间断性跪坐对血小板及血红蛋白含量的影响

第二批参加实验的实验组和对照组同学于第0周和第4周测试毛细血管脆性后进行血常规检测，观察间断性跪坐4周对受试者血小板和血红蛋白含量的影响。

1.4 数据统计

实验数据采用Student′st检验。

2 结果

2.1 两种缺血再灌注方法对腓肠肌肌氧含量的影响

统计两种不同阻断血流方法下3个缺血再灌注周期中每次缺血和复灌第1分钟和5分钟末的肌氧含量数据，发现每次阻断血流后，肌氧含量便开始持续下降，至第1分钟末已经有显著降低（与本轮缺血前比较P＜0.05）。与血压带200 mmHg阻断血流比较，跪坐法缺血导致肌氧含量降低更迅速。5 min末大部分受试者肌氧含量降至0，第1、5分钟末该值下降两组差异均有统计学意义（P＜0.01）。复灌期的肌氧含量在第1分钟两法相似，会短暂上冲至比正常值高，旋即肌氧含量又稍降低然后基本稳定。跪坐法降低的幅度大于束缚法，在复灌I和II中，第5分钟末降低后的值与血压带束缚法比较差异有统计学意义（P＜0.01），但总体降低幅度并不明显，与自身正常值比较差异无统计学意义，结果见表1。

表1 间断性血压带束缚法或跪坐法对腓肠肌肌氧含量的影响（±SD，n=12） /%Tab.1 Influence of intermittent blood pressure cuff inflation and intermittent seiza on tissue oxygenation of gastrocnemius

表1 间断性血压带束缚法或跪坐法对腓肠肌肌氧含量的影响（±SD，n=12） /%Tab.1 Influence of intermittent blood pressure cuff inflation and intermittent seiza on tissue oxygenation of gastrocnemius

注：与本轮缺血前比较，＃：P＜0.05；※：P＜0.01；与束缚法相比，∗：P＜0.01。

方法 正常5 min 25.3±14.70*4.9±7.36*※60.3±9.97 59.2±10.24束缚法跪坐法5 min 64.0±6.00 56.4±6.76*5 min 28.0±13.00※6.1±9.20*※方法束缚法跪坐法缺血Ⅰ1 min 48.2±9.85*32.9±13.44*※复灌Ⅱ1 min 70.8±12.4 65.6±13.10 5 min 61.0±7.60 50.2±7.92*复灌Ⅰ1 min 69.0±12.07 66.0±11.00缺血Ⅲ1 min 51.7±8.74＃37.3±8.98*※5 min 25.0±14.00※4.8±7.01*※缺血Ⅱ1 min 56.0±7.91＃39.3±12.44*※复灌Ⅲ1 min 67.7±8.91 66.9±11.50 5 min 63.0±8.00 55.3±10.40

2.2 重复间断性跪坐对毛细血管脆性的影响

预实验发现，束臂8 min时大部分同学毛细血管脆性正常，当采用了改进的测试法即延长束臂时间（至15 min）后，则出血点超过10个的同学明显增加（未发表资料），且延长束臂时间没有出现更多不适症状，提示改进法可以作为筛选毛细血管脆性隐性增高人群的方法。为了更好观察到间断性跪坐RIPC对皮肤毛细血管脆性的作用，本实验测试采用改进法进行。结果表明，在生活学习及作息运动规律相似的同学之间，每日进行间断性跪坐的同学2周后部分同学皮肤出血点已经减少，对照组13人，出血点个数为（24.7±19.21），实验组20人，出血点个数为（18.0±13.59），后者与0周比较，P=0.06），4周后均有显著改观，与自身实验前及对照组比较减少差异有统计学意义（P＜0.01），表明间断性跪坐4周后毛细血管脆性明显降低了，或者说毛细血管质量改善了，结果见表2。

表2 重复间断性跪坐对大学生毛细血管脆性的影响（±SD） /出血点个数Tab.2 Influence of repeated intermittent seiza on capillary fargility of students

表2 重复间断性跪坐对大学生毛细血管脆性的影响（±SD） /出血点个数Tab.2 Influence of repeated intermittent seiza on capillary fargility of students

注：与实验组与0周及对照组4周比较，a表示P＜0.01。

4周24.6±17.21 9.5±6.33a组别对照组实验组人数27 34 0周24.2±16.39 27.3±16.90

2.3 重复间断性跪坐对血压的影响

参加实验的同学血压在正常范围，4周实验后收缩压和舒张压变化较小，差异无统计学意义，结果见表3。实验组4周时收缩压及舒张压与其0周及对照组比较差异均无统计学意义。

表3 重复间断性跪坐对血压的影响（±SD） /mmHgTab.3 Influence of repeated intermittent seiza on blood pressure

表3 重复间断性跪坐对血压的影响（±SD） /mmHgTab.3 Influence of repeated intermittent seiza on blood pressure

收缩压 舒张压组别 人数4周67.1±8.78 66.8±7.43对照组实验组27 34 0周105.3±10.78 102.5±8.58 4周103.7±9.56 99.1±7.76 0周70.1±7.07 68.9±8.02

2.4 重复间断性跪坐对血小板和血红蛋白含量的影响

检测发现参加实验的两组同学血小板及血红蛋白含量的两次测试结果都在正常范围内，两次测试数据的自身前后配对及组间t检验均无明显差异。表明每天间断性跪坐30 min，连续实施4周对血小板及血红蛋白含量没有显著影响，结果见表4。实验组4周时血小板数量及血红蛋白含量与其0周及对照组比较差异均无统计学意义。

表4 重复间断性跪坐对血小板及血红蛋白含量的影响（±SD；n=14）Tab.4 Influence of repeated intermittent seiza on platelet and hemoglobin content

表4 重复间断性跪坐对血小板及血红蛋白含量的影响（±SD；n=14）Tab.4 Influence of repeated intermittent seiza on platelet and hemoglobin content

组别对照组实验组血小板数量/（×109·L-1）0周229.6±31.36 227.3±45.07 4周215.1±48.80 214.9±51.51血红蛋白含量/（g·L-1）0周142.6±14.71 137.1±9.26 4周138.5±16.92 134.9±8.26

3 讨论

缺血预适应的理论被提出已近32年[1]。其转化医学历程从有创性心脏冠脉应用到肢体无创性RIPC应用经历了16年[3]。随后多年的众多临床研究文献[7]中，既表明RIPC能对缺血脏器起到有效保护作用[8]，还能够改善运动功能[9]，也有许多报道其保护作用并不明显[10]。不过不难发现的是，大部分RIPC的临床研究是术中由医护人员采取实施一次或两次（加上术后RIPostC）肢体RIPC。由于手术中众多其他因素的干扰，有时很难得出RIPC是否产生保护效应的结论。既然实施一次RIPC便能获得一定效果，如果每天实施这种保护作用是否有累积效应呢？MENG等[11]对中风病人采用每天两次用血压表加压进行RIPC，连续180天，获得了良好的防治效果。如果能找到更加简单易行的RIPC方法则有利于其在大众中的预防应用。本研究正是旨在建立一种普通人可自助实施的RIPC方法。

早期的缺血预适应是在动物实验过程中通过直接阻断动脉的血流造成相应器官缺血，然后解除阻断完成再灌注的[1]，阻断动脉和解除阻断都能迅速达成。具有体外应用价值的无创性远程缺血预适应是通过止血带或血压带束缚上臂或大腿，充气加压到200 mmHg以压迫肱动脉或股动脉阻断血流造成前臂或小腿组织缺血，然后放气复灌的。与直接手术阻断动脉不同，血压表充气加压往往需要数秒甚至十余秒钟时间才能达到需要的压力值，这种环肢体加压束缚除了阻断动脉血管也同时阻断了皮肤静脉回流，并且由于静脉位置比动脉表浅且壁薄往往先于动脉被阻断，而动脉继续灌流会造成前臂或下肢血管床过度充盈，受试者会感觉胀痛不适，因而有些人心存顾虑，难以长期坚持。

人体的某些姿势可以导致血管受压，如打坐时的下肢相挤压、下蹲时的股动脉和腘动脉受压以及跪坐时的腘动脉受压。其中跪坐姿势因为占地面积小、姿态端庄雅致、起坐方便，作为人类的正坐姿势被使用了数千年。研究表明跪坐会阻断腘动脉血流[4]，持续30 min以上的跪坐会导致下肢功能甚至结构障碍。如果换个角度思考，可以利用跪坐对腘动脉的阻断作用，采用间断性跪坐来实施缺血预适应。本实验通过比较间断性跪坐与已经被认可的加压束缚肢体法对人产生的下肢缺氧效果，证明了两种方法结果的一致性。从腓肠肌的肌氧含量变化来看，跪坐时肌氧含量下降更迅速和更彻底可能与跪坐对腘动脉的阻断作用几乎在坐下同时就能达成有关；而加压束缚肢体时充气需要时间相对较长，对血流阻断的过程缓慢并引起动脉充盈导致肌氧含量下降慢。因此可以认为间断性跪坐产生的缺血预适应更接近于理想中的效果。此外跪坐对皮肤表浅静脉的回流影响较小，短时间（5 min）内不会有肢体皮肤胀痛等现象产生，更易于被受试者接受。

毛细血管脆性主要反映了皮肤微血管在管内压力增高时保持结构和功能完整性的能力或者说弹性大小，并与血小板有关。当血管弹性降低或脆性增高时，或者血小板减少时，管内压力增高就容易导致管壁破裂，表现为出血点。在毛细血管中，血管内皮细胞是管壁的主要结构，因此毛细血管脆性试验能够反映血管内皮细胞的结构和功能状况。本实验结果表明实验4周前后血小板数量没有明显改变，实验组出血点明显减少主要和毛细血管功能改善有关。缺血预适应及RIPC对血管的保护作用机理之一是保护血管内皮细胞的结构及功能[5]。研究表明缺血预适应是一种全身性反应，其产生与机体一系列内在保护性机制被激活有关，涉及到内源性阿片系统、腺苷系统、自体活性物质体系如前列腺素、缓激肽、一氧化氮等等。无创性RIPC可以重复进行，反复实施不仅表现出对可能缺血器官的预保护作用，对已经发展形成的心、脑、血管系统疾病还表现出良好的治疗作用，如临床上常用于辅助治疗高血压、动脉粥样硬化、脑中风后遗症等，并取得一定疗效。有研究[12]通过模拟人类跪坐的小鼠屈膝实验结果证明，重复7 d进行间断性小鼠屈膝与间断性束缚小鼠大腿产生的缺血预适应效果相似，都能显著延长小鼠常压耐缺氧时间和大脑耐缺血时间，提示对高原病的防治可能也有一定效果。本文通过改进的毛细血管脆性实验证明，即便对于毛细血管基本正常的人群，每日坚持间断性跪坐实施RIPC，其毛细血管结构和功能也会得到进一步改善。毛细血管是血管床的一部分，可以推测间断性跪坐RIPC对较大的血管功能和结构也可能产生改善作用，值得进一步研究。

间断性跪坐不需要特殊设备且方便实施，只要持续正坐不超过30 min便不会由于缺血引起小腿和脚的明显功能性损伤[4]。与局部缺血预适应相似，一次RIPC后也可产生即时性和延迟性两个阶段的保护作用，前者持续约3 h，后者在12 h后再出现并维持3 d。如果每天练习30 min的间断性跪坐，则意味着机体的血管系统将持续处于缺血预适应的保护作用中，这对于防治血管性疾病及相应器官的缺血性损伤具有明显的价值。