戒毒一号对甲基苯丙胺诱导的小鼠学习记忆损伤的改善作用

段家名，周 梅，李超英

（江汉大学 武汉生物医学研究院，湖北 武汉 430056）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）是一种人工合成的中枢神经兴奋剂，自20世纪90年代以来，甲基苯丙胺成为世界上流行最快、滥用最为广泛、危害最为巨大的新型毒品[1-3]。长期滥用会产生高度成瘾性，损伤脑的结构和功能，从而影响认知功能[4]。认知损伤具体表现在学习记忆损伤、注意力涣散等方面[5]，其中学习记忆损伤最为突出[6]。许多成瘾理论认为，学习记忆损伤导致的抑制力或执行力缺失是成瘾的标志性特征，会导致持续的药物滥用行为且使成瘾难以治疗[7-9]。因此改善甲基苯丙胺导致的学习记忆损伤对治疗甲基苯丙胺成瘾者具有重大意义。

戒毒一号是本实验室从大量中药中筛选的有效复方，由中药延胡索等8味中药提取而成，又经过了一系列的质量控制和安全评价试验，保证了戒毒一号的稳定性和安全性。

本次实验研究戒毒一号对甲基苯丙胺诱导小鼠学习记忆损伤的影响。通过建立甲基苯丙胺记忆损伤动物模型，给予戒毒一号，用Morris水迷宫检测动物空间学习记忆能力，研究戒毒一号对甲基苯丙胺诱导的学习记忆损伤是否具有改善作用，为该药应用于改善甲基苯丙胺所诱导的学习记忆损伤提供实验依据。

1 实验材料及方法

1.1 动物

本研究使用C57BL/6雄性小鼠，8～10周年龄，体重（22±2）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（动物合格证号：SCXK（京）2016-0011）。小鼠饲养在温度（23±2）℃、湿度（50±5）%、12-h光/黑暗循环的环境中，食物和水充分供应。所有关于动物实验的操作均符合江汉大学医学伦理委员会要求。

1.2 药物

戒毒一号总重94 g（各组分中药购买自湖北天济中药饮片公司），用1 400 mL水煎煮中药至400 mL，浓缩成所需浓度的浸膏，用ddH2O配成低、高剂量组（14.12、56.48 kg/mL），灌胃给药（0.1 kg/mL）。戒毒一号是本实验研究的临床效验方，由延胡索、党参、西洋参、甘草、茯苓、白术、黄芪、当归8味中药组成，各单位药对应剂量分别为10 g、15 g、3 g、10 g……。

1.3 建立甲基苯丙胺记忆损伤模型

腹腔注射（ip）甲基苯丙胺，10 mg/kg/次/d，连续注射7 d，建立甲基苯丙胺诱导学习记忆损伤模型[10]，如图1所示。造模成功后，从中随机选出12只作为低剂量组、12只作为高剂量组（灌胃给药）。从Mor⁃ris水迷宫预适应阶段开始给药，低剂量组灌胃（ig）14.12 g/kg戒毒一号，高剂量组灌胃56.48 g/kg戒毒一号，其他两组给予等量的生理盐水，见表1。

图1 整体实验流程图Fig.1 Overall flow chart for experiment

表1 动物分组及给药方式Table.1 Animal grouping and administration methods

1.4 用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆

Morris水迷宫（上海欣软信息科技有限公司，XR-XM101）主要由一个游泳池、一个摄像机和一个分析系统组成。将直径120 cm、高50 cm的水迷宫圆形水槽注满水，水深约为21 cm，保持水温（23±2）℃，倒入二氧化钛（一种食品添加剂，安全、无毒）混匀使其背景为白色。将一直径为6 cm的平台置于水迷宫东北象限（即目标象限），平台表面低于水面1.5 cm。水迷宫实验主要分为三阶段：预适应阶段、训练阶段和测试阶段。记录小鼠的游泳轨迹，通过逃避潜伏期和穿梭平台的次数来评价实验动物的空间学习能力和空间记忆能力。

水迷宫前两天为预适应阶段：将每只小鼠从相同的位置放入水中，使其在水迷宫中自由游泳1 min。进行该阶段的目的为消除小鼠对水的恐惧，使小鼠适应环境，避免环境因素带来的实验误差。

水迷宫训练阶段：在这个阶段平台固定在东北象限正中间，置于水下1.5 cm。每次训练小鼠要从不同的位置进入水迷宫，每只小鼠同一个位置每天只训练一次，并且每天训练的起始位置不同（见表2）。

表2 Morris水迷宫训练阶段每次的起始位置Tab.2 Spatial start positions of each time in Morris water maze

记录小鼠游泳轨迹，小鼠从进入水中到找到水下平台的时间（s）为逃避潜伏期。每次训练间隔为15～20 min，连续训练5 d。如果小鼠在60 s未找到水下平台，则引导小鼠游到平台，使其停留10 s。训练完毕后将小鼠身体擦干，置于白炽灯下烘干身体后放回笼内。将小鼠的游泳速度作为评价小鼠运动能力的指标，将逃避潜伏期作为小鼠空间学习能力的评价指标。

水迷宫测试阶段：第6天撤除原平台，将所有实验动物从相同的入水点放入水中，记录小鼠在1 min内穿梭原平台的次数和穿梭目标象限的时间，以此作为小鼠空间记忆能力的评价指标。

1.5 数据分析

所有数据采用SPSS23.0软件进行统计处理，实验结果均以mean±SEM表示，小鼠的游泳速度和训练阶段的逃避潜伏期采用重复测量方差分析，检测阶段的实验结果采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 小鼠的游泳速度

检测各组小鼠在整个水迷宫阶段的游泳速度，游泳速度的差异性能够反映出甲基苯丙胺和戒毒一号对小鼠运动能力的影响作用。实验结果表明，尽管在第一天有轻微的影响，整体来看，模型组和给予戒毒一号组差异并没有统计学意义（见图2）。结果表明给予甲基苯丙胺和戒毒一号并不影响小鼠的运动能力，因此排除了运动能力对学习记忆能力改变的干扰。

图2 小鼠在学习阶段和记忆检测阶段的游泳速度Fig.2 Swimming speed of mice in both learning and memory testing phases

2.2 戒毒一号对甲基苯丙胺诱导小鼠学习损伤的影响

与对照组相比，模型组的逃避潜伏期明显比对照组长，且在第4天和第5天差异有统计学意义（P＜0.05），说明模型组出现了学习能力损伤，造模成功；与模型组相比，低剂量组的逃避潜伏期明显缩短，且在第4天和第5天差异有统计学意义（P＜0.05），说明戒毒一号低剂量改善了甲基苯丙胺诱导的小鼠的学习损伤；高剂量组与模型组相比，逃避潜伏期有缩短的趋势，但是差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。

训练阶段的实验数据表明：戒毒一号能够改善甲基苯丙胺诱导的学习损伤。

图3 训练阶段的逃避潜伏期Fig.3 Escape latency during learning phase

2.3 戒毒一号对甲基苯丙胺诱导小鼠记忆损伤的影响

统计检测阶段小鼠穿梭平台的次数结果见图4。与对照组相比，模型组在单位时间内穿越平台的次数显著下降（P＜0.05），表明模型组的空间记忆能力受损；与模型组相比，低剂量组在单位时间内穿梭平台的次数显著提高（P＜0.05），表明戒毒一号低剂量组的空间记忆能力得到了改善；高剂量组与模型组相比，高剂量组在单位时间内穿梭平台的次数与模型组相比有增加的趋势，但是差异无统计学意义，表明高剂量具有改善小鼠的空间记忆能力的趋势。从检测阶段小鼠穿梭目标象限的时间来看（见图5），模型组穿梭目标象限的时间与对照组相比显著缩短（P＜0.05）；低剂量组与模型组相比显著延长（P＜0.05）；高剂量组与模型组相比，穿梭目标象限的时间也有增加的趋势，但是差异无统计学意义，这表明了低剂量的戒毒一号改善了小鼠的空间记忆能力，而高剂量在一定程度上也具有能改善小鼠的空间记忆能力的趋势。图6为检测阶段各组小鼠代表性运动轨迹。

综合检测阶段的实验数据表明，戒毒一号能够改善甲基苯丙胺诱导的记忆能力损伤。

图4 检测阶段穿梭平台的次数Fig.4 Times of platform crossing in testing phase

图5 检测阶段穿梭目标象限的时间Fig.5 Time of objective quadrant crossing in testing phase

图6 水迷宫检测阶段具有代表性的小鼠运动轨迹Fig.6 Representative motion trajectory of mice in water maze test

3 讨论

Morris水迷宫是医学上用于检测动物空间学习和记忆能力的经典方法。本实验结果表明，戒毒一号（14.12 g/kg）能够显著减少甲基苯丙胺诱导小鼠的逃避潜伏期，表明其具有良好的改善空间学习能力；能够使甲基苯丙胺诱导的小鼠在单位时间内穿梭平台的次数增加和穿梭目标象限的时间增加，这表明其具有改善空间记忆能力。总体实验结果表明戒毒一号改善了甲基苯丙胺诱导的学习记忆损伤。

戒毒一号是由延胡索、当归、西洋参等中药制成的复方。其中主要成分延胡索乙素（l-THP）是从罂粟科（papaveraceae）紫堇属（CorydalisDC.）植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥块茎中提取出来的[11]。研究表明延胡索及其有效成分延胡索乙素是一种新型的多巴胺受体（DA）抑制剂，并且长时间服用没有成瘾性[12-13]。龚晓康等[14]的研究表明l-THP能够拮抗甲基苯丙胺对中枢神经的刺激作用和毒理作用，保护中枢神经系统。

EGAN等[15]研究表明，中枢神经系统的中脑-边缘系统的DA系统在认知学习过程中起着关键性作用，D1和D2受体都参与了记忆的调控过程，并且脑内DA的缺乏和过量与认知功能有着密切的关系。因此这在一定的程度上解释了戒毒一号可能是通过抑制多巴胺释放，通过多巴胺系统改善了小鼠的空间学习和记忆能力。戒毒一号中其他配伍药物当归、茯苓和西洋参的不同成分都在一定程度上具有改善学习能力的作用。王虎平等[16]研究发现当归多糖可能通过改善胆碱能神经递质、提高抗自由基氧化能力及促进β-淀粉样蛋白的代谢，改善老年痴呆模型大鼠学习记忆能力；张敏[17]发现茯苓多糖能够改善老年痴呆模型小鼠学习记忆能力；刘凯等[18]研究发现短期内给予西洋参茎叶中的人参皂苷对动物受损伤的学习记忆功能有改善作用。因此，戒毒一号是以延胡索为主，其他药物为辅，协同改善了甲基苯丙胺诱导的学习记忆损伤。

综上所述，本实验表明戒毒一号具有改善甲基苯丙胺诱导的学习记忆损伤作用，其主要机制可能与其抑制多巴胺通路而改善了学习记忆能力。本实验已经从行为学上检验了戒毒一号对甲基苯丙胺诱导学习记忆损伤的作用，后续还可以继续研究与学习记忆相关的分子机制。