深低温冻存同种异体血管的临床应用进展

蔡超操,王 成,陈世玖

(遵义医学院第五附属(珠海)医院手外科,广东 珠海519000)

在血管外科和器官移植外科手术中,使用血管移植材料移植重建血管变得越来越常见。目前使用的血管移植物包括自体静脉血管、人造血管及同种异体血管。自体血管来源有限,并受管径大小、取材长短等限制,使血管移植的应用受到制约[1]。人造血管材料(涤纶、聚四氟乙烯、天然真丝等)的出现改善了这种情况,但人工血管移植也存在不良反应,如需使用抗凝药和免疫抑制剂等,远期通畅率较低[2],且不能完全达到管径小于6 mm的小血管移植的要求[1,3]。同种异体血管具有管径易匹配、采样方便、结构相似等优点,并可大量获得,具有一定优势。同种异体血管的保存需要使用冷冻保护剂，冷冻保护剂是一些化合物, 置于保存组织的溶液中能够保护组织不被冻伤；此外，冷冻保护剂可以选择性抑制同种异体抗原呈递细胞并降低血管免疫原性,抑制排斥反应[1,4]，但冷冻保护剂也易使细胞及细胞发生毒性效应和渗透性损伤，因此冷冻保护剂的选择及其使用的优化是深低温冻存技术的关键点。

1 冷冻保护剂

冷冻保护剂是由不同成分和比例的化学试剂组成，在低温冷冻期间，冷冻保护剂可以消除被保存器官低温时产生的冰晶，从而起到保护器官的作用[5-7]。研究者最初发现，低温保存精子时加入甘油可以显著提高精子的活力，随后人们又陆续发现了其他冷冻保护剂，如二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇等[8]。

2 冷冻保护剂的分类

根据能否渗透进入细胞通常将冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两类。

2.1渗透性保护剂 主要是醇类，以二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇为代表。该类保护剂可与溶液中的水分子结合，发生水合作用，使溶液的黏性增加，减缓降温过程中水分子结晶的形成，减轻“细胞内冰晶损伤”，从而保护细胞和组织；此外，在冷冻保存过程中，渗透性保护剂的加入可以稀释溶液中的溶质，使细胞内外侧的离子浓度差降低，减少离子进入细胞，从而起到保护作用；同时，渗透保护剂渗透入细胞，避免细胞处于过冷状态，使细胞内的压力与外界接近，减少“溶质损伤”，降低冷冻过程中细胞脱水引起的细胞收缩程度和时间[7，9]。此外，在解冻复温过程中，这类保护剂可以渗透性地进出细胞，能够减弱高浓度差所致的渗透性水肿，减轻细胞和组织的损伤。当渗透性保护剂的浓度升高时，其玻璃化冻存的效果更好，但高浓度低温保护剂的毒性也随之增加，对细胞及组织的损伤也随之增大[9]。

2.2非渗透性冷冻保护剂 主要是大分子物质，如果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖以及分子量>1 000的大分子化合物(聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉等)[10]。非渗透性保护剂的加入可降低某特定温度电解质的浓度，改善保护液的玻璃化性质，减轻溶质损伤；此外，由于该类保护剂位于细胞外，不能自由通过细胞膜，使细胞外侧渗透压增大，细胞内外侧渗透压差增大，细胞内的水分子移动到细胞外，细胞内水分子减少，细胞内冰晶形成减少，促使细胞膜稳定，降低冷冻保护剂达到玻璃化状态所需的浓度，降低玻璃化溶液的毒性[9]。大分子非渗透性物质(聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉等)也可以溶解在溶剂中，但由于不能自由穿过细胞膜，溶液中加入该类保护剂后可表现为过冷状态，抑制了细胞外冰晶的形成，减少了细胞损伤。

由于在冷冻过程中使用了渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，从而降低了渗透性保护剂的使用浓度，减少了渗透性保护剂的毒性作用；复温过程中，细胞外较高的渗透压环境避免了溶剂中的水较多、较快地进入细胞而引起的细胞肿胀，使细胞和组织的冻存效果更好。通常玻璃化溶液中渗透性保护剂的浓度不应低于30%，非渗透性保护剂蔗糖的浓度通常为0.1～1 mol/L[11]。海藻糖不同于其他非渗透性保护剂，可使蛋白质折叠得更加稳定，在低温环境中，通过“水替代”“玻璃态”及“化学稳定性”3种机制起抗冻作用[12-14]。

3 深低温保存血管的临床应用

深低温保存血管是指将分离的同种异体血管置于含冷冻保护剂的冷冻管中，经梯度降温后，最后保存于-196 ℃的液氮中。深低温保存可降低血管的免疫原性，保留血管的生物学活性，保证血管移植后的通畅率，经深低温保存的血管可广泛用于临床实践[15]。

3.1用于各种血管损伤和动脉瘤 在创伤中常合并血管损伤，治疗上需进行血管移植以恢复组织器官血供。人造血管移植主要用于修复大血管缺损，修复小血管缺损的效果不理想。早期采用冷冻，戊二醛、乙醇浸泡等方法降低了血管移植物的抗原性，增加了血管的通畅率。温树正等[16]采用冷冻保存的同种异体血管修复血管缺损6例7条(其中左小指双指动脉各缺损1例、桡动脉缺损1例、尺动脉缺损1例、腕部桡动脉外伤性动脉瘤1例、左胫前动脉损伤1例、右小腿大隐静脉缺损1例)，血管缺损长度为1.0～15.0 cm，平均4.75 cm，移植血管长度为1.2～16.0 cm，平均5.37 cm，冷藏时间为1.0～4.5个月，平均2.75个月。6例患者中，5例术后效果良好，移植血管血流通畅。姬亚飞等[17]应用深低温保存的血管移植修复13例血管损伤(腘动脉5例、尺动脉3例、桡动脉3例、指动脉2例)，术后11例成活，2例闭塞，随访发现移植成活的血管血流畅通，无排斥反应，但当移植血管直径<1 mm时易栓塞。在2例肾移植后髂外动脉感染曲霉菌的动脉瘤患者中，Minz等[18]成功地使用了自体髂内动脉移植物修复了髂外动脉缺损。Cho等[19]使用冷冻保存的同种异体血管移植修复治疗1例婴幼儿巨大特发性先天性肾下腹主动脉瘤，手术成功，术后疗效可。Petrunic等[20]采用冷冻保存的同种主动脉移植物成功修复1例真菌性肾上主动脉瘤并左腰肌脓肿。低温保存的主动脉同种异体移植物允许在感染的情况下进行主动脉重建，其早期和长期发病率和死亡率低于其他先前报道的治疗方案[21]。

同种异体移植血管的血流通畅率受外源性和内源性因素的影响，其中血管通畅率主要受内源性因素影响，如免疫排斥反应、管壁结构的病理改变；外源性因素主要是手术技术缺陷，如吻合口狭窄、扭曲等。如何减少内源性影响因素并提高手术技术是提高血管移植通畅率的关键。

3.2用于先天性/后天性心脏病 1962年,Ross和Somerville[22]首次应用同种异体血管移植治疗复杂先天性心脏病合并肺动脉闭锁。经过数十年的研究发展，关于心脏瓣膜的基础研究和临床运用取得了长足的进步。目前，心脏瓣膜分为机械瓣膜和生物瓣膜，其中生物瓣膜分为3类：异种生物瓣膜、同种异体心脏瓣膜以及组织工程瓣膜。经过长时间的临床运用与后期随访，各种瓣膜的优缺点逐步显露出来。机械瓣植入后易形成栓塞，使用抗凝药物后又易出现抗凝相关的并发症，所以并不是理想的心脏瓣膜[23]。异种心脏瓣膜易发生退行性变和钙化，致使心脏瓣膜结构发生改变，从而引起心脏功能不全，泵血量不足以维持有效的血液循环，远期效果欠佳。冷冻保存的人体同源心脏瓣膜不仅具有正常瓣膜的形态结构和生理功能，而且具有良好的动力学性质和生物学活性，比异种生物瓣膜更耐用[24]，但同种瓣膜也不可避免地存在钙化和退行性变。

初期，同种异体心脏瓣膜主要用于治疗婴幼儿和儿童的复杂先天性心脏病，新生儿心脏病患者右心房与右心室内血流速度较慢，压力较低，机械瓣膜置换后易形成血栓，而同种异体瓣膜置换后效果较好[25]。目前同种异体心脏瓣膜已广泛用于治疗各年龄段的先天性/后天性心脏病，由于移植的同种异体瓣膜与受体种类相同，移植后细菌不易黏附，血栓形成率较低，效果好，已成为治疗感染性心内膜炎合并瓣膜病变的重要方式[24，26]。孙衍庆和杨能善[27]使用同种异体大血管(带瓣主动脉、带瓣肺动脉和胸主动脉)移植治疗复杂小儿先天性心脏病5例，术后4例恢复良好，无并发症，患儿痊愈出院，1例因严重低心排血量、肾功能不全而死亡。术后随访证实,同种异体血管移植物血流动力学良好，瓣膜的形态及功能正常，免疫排斥指标也无明显升高，无明显排斥反应。廖崇先等[28]采用液氮深低温保存的同种异体带瓣大血管治疗复杂先天性心脏病4例，术后3例痊愈出院，1例因低氧血症、低心排血量及肾功能不全而放弃治疗，晚期随访发现同种异体大血管移植物具有良好的血流动力学和正常的瓣膜功能，证实使用异体瓣膜移植治疗复杂先天性心脏病的可行性。但如何预防和延缓瓣膜钙化并延长瓣膜的使用时间还需要进一步研究。

3.3用于建立血液透析通路 对于肾脏病终末期患者，良好的血液透析治疗能有效提高患者的生活质量并延长患者的生存期，良好的透析途径对血液透析的建立至关重要。与人工血管相比，同种异体血管具有良好的组织相容性，较小的免疫原性，植入后排斥反应小，内瘘发生感染后易于控制。钟伟强等[29]的研究证实，与使用人造血管制作的动静脉瘘相比，同种异体移植血管制作的血液透析通路的通畅率高，并发症少。刘声茂等[30]对分别采用人造血管和同种异体血管制作血液透析通路的脓毒症患者进行比较发现，聚四氟乙烯人造血管内瘘较同种异体血管内瘘的平均使用时间短、血液透析后的止血时间长，且费用较高。Ha等[31]研究证实，采用冷冻保存的同种异体动脉移植重建上臂的血液透析通路，可以在移植血管未愈合的情况下即刻行血液透析。Jadlowiec等[32]的回顾性研究证实，在血液透析通路的建立中，使用冷冻保存的同种异体静脉的通畅率与使用聚四氟乙烯作为血管移植物的通畅率相当，并可以终身维持透析通路。对需要在感染的情况下建立血管通路的患者，更应考虑使用冷冻保存的同种异体静脉建立透析通路。综上所述，与人造血管相比，同种异体血管内瘘在使用时间、止血时间、医疗费用等方面具有一定优势。

3.4用于器官移植 器官移植时，供体器官需与受体完成血管重建，形成血流通路。通常因供体器官与受体间的血管直径不匹配而需要采用血管移植物进行血管重建，以维持血液供应。血管移植物的来源有自体血管和同种异体血管，自体血管来源有限，受管径匹配、取材长度等限制，而同种异体血管的管径、长度可与靶血管匹配，移植拼接较简单。张克明等[33]在3例乙型肝炎相关肝癌肝移植患者中使用冷冻移植静脉重建肝流出道，随访发现，使用同种异体静脉重建的静脉流出道的血流畅通，无血栓形成及栓塞，证实使用冷冻异体静脉重建肝脏流出道是安全可靠的，既保证了供者的生命安全，还降低了小肝综合征的发生率，使活体右肝切除术得以进一步发展。关兆杰等[34]研究了采用冷冻保存的髂静脉重建肝中静脉行肝移植的患者发现，冷冻保留的髂静脉是成人右肝移植肝静脉重建的理想材料。

3.5应用于各种恶性肿瘤 对于侵犯周围重要血管的恶性肿瘤，采用传统手术方式剥离肿瘤时常损伤血管，或无法剥离干净，致使肿瘤常常复发。要想彻底切除肿瘤，延长患者的生存期，应完整切除肿瘤及浸润的血管，并行血管移植重建。血管移植物的选择及血管重建技术是影响该类手术预后的重要因素。郑树森等[35]研究发现，在胰腺癌手术过程中可采用同种异体血管行血管重建。张晓刚等[36]应用深低温保存的人髂血管作为血管移植物对肝细胞肝癌和胰腺癌侵犯的血管进行重建，术后无并发症发生。王伟林等[37]分别采用冻存的异体门静脉(4例)和异体髂动脉(10例)行移植重建的胰腺癌患者，研究发现，同种异体血管作为胰十二指肠切除术术中门静脉的替代物具有生物学、结构学优势。武峤等[38]应用低温保存的异体髂血管联合髂内和髂外血管作为血管移植物，在根治性胰十二指肠切除术治疗合并血管侵犯的胰腺癌患者中进行血管重建，术后随访疗效好，但5年生存率还需进一步研究。

4 小 结

作为理想的血管移植材料，同种异体血管有着广泛的科研和临床应用价值。同种异体血管的保存影响着研究的进展和临床应用，如何选用合适浓度及种类的冷冻保护剂保存血管，使既能保持同种异体血管的生物学活性，又能降低免疫原性、维持远期通畅率，仍需要进一步的探索与研究。期待在不久的将来能够找到更适合的血管深低温保存方法，从而建立“血管银行”，为科研及临床工作提供更加合适的血管。