3D打印脱细胞外基质支架修复软骨缺损的研究进展

王议峰，李松军

(遵义医学院第五附属(珠海)医院骨一科，广东 珠海 519100)

关节软骨缺乏营养供应，损伤后自我修复能力差[1]，从而导致长期的关节疼痛和功能障碍，甚至关节废用，给患者带来极大的痛苦和不便。传统的软骨修复方法，如微骨折术、软骨下钻孔术、骨膜移植等，修复的是纤维软骨，在组织学上纤维软骨与周围正常软骨不同[2]，导致疗效不佳。近年来，对制备组织工程支架所需的3D 打印材料——生物油墨研究较多，利用该材料制备的3D支架与软骨缺损部位解剖外形吻合，同时具有细胞黏附、增殖所需三维结构以及支架材料所必需的机械强度，这给软骨损伤及缺损的修复带来了希望。目前，3D打印材料种类繁多，选择合适的材料作为生物油墨是3D生物打印成功的关键一步[3]。迄今为止，以天然生物聚合物为基础的水凝胶，如海藻酸盐[4]、明胶[4]、胶原蛋白[5]、纤维蛋白[5]、透明质酸[6]和壳聚糖[7]等，已被证明具有生物油墨的一些基本特性。这些生物油墨不仅可以作为3D支架的基础，还可以维持和促进细胞的活性。尽管如此，在固有细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中模仿错综复杂的结构仍然存在困难[8-9]。此外，每个组织都有固有的ECM组成结构，使得理想的ECM拟态的构建可能超出任何组织工程技术的制造能力[10]。脱细胞外基质(decellularized extracellular matrix, DECM)被认为是最有前途的替代材料之一。现总结DECM支架修复软骨缺损的研究现状，并总结在研究和应用中所遇到的问题及发展方向。

1 DECM支架修复软骨缺损的机制

1.1促进软骨细胞黏附增殖 DECM具有良好的组织相容性，细胞可通过自身表面抗原与其结合，从而提高了细胞的黏附性。Kang等[11]运用人关节软骨DECM构建3D支架，这种支架可以支持间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的细胞黏附与增殖。而目前有研究证实，与纯聚合物相比，DECM的天然蛋白质或多糖与合成聚合物的组合使磷酸化黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, pFAK)表达增加，从而增强细胞黏附和增殖[12]。其主要机制为:pFAK通常用作细胞/材料相互作用的重要生物标志物，它通过细胞信号通路对细胞周期、黏附增殖进行调控。细胞信号通路常在细胞-ECM相互作用下被触发，使细胞生长因子上调，然后通过在黏着斑点处直接结合整合素β1的细胞质结构域来激活FAK。研究发现FAK是整合素信号转导的重要介质，这种整合素介导的细胞黏附促进了FAK的自身磷酸化[13]。之后，pFAK调节局灶性接触，形成细胞扩散和诱导细胞运动所必需的信号通路[14]。据报道，pFAK还可进一步激活细胞外信号调节激酶，从而增强细胞增殖[15]。鉴晓东等[16]运用羟基丁酸-羟基辛酸共聚体(poly hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate,PHBHOx)/DECM构建组织工程支架，并进行细胞-支架培养，24 h后进行细胞黏附率测定，发现实验组支架的细胞黏附率及细胞增殖数量明显高于对照组，并且随着PHBHOx与DECM复合比例的变化，支架的细胞黏附率及细胞增殖数量也随之变化。Shakouri-Motlagh等[17]发现，与在TCP上扩增的MSC相比，在DECM上扩增的MSC数量显著增加。DECM因自身结构能够促进细胞黏附增殖，与其他支架材料构建的复合物增强了细胞增殖与黏附的效果，这为通过组织工程支架搭载多能分化细胞进行软骨缺损修复提供了理论基础。

1.2促进干细胞定向分化 能够促进细胞增殖、分化是理想的组织工程支架的基本条件之一。近年来，DECM作为生物油墨构建3D支架，受到广泛关注。DECM与ECM结构及组成相似，而组织器官的机械强度部分依赖于ECM,因此，不同强度对ECM的机械刺激，可影响细胞行为。研究显示，MSC可以识别基质的硬度，并根据基质硬度分化成不同的谱系[18]。同时，ECM可以下调可溶性因子的活性。其蛋白多糖可以与骨形态发生蛋白的抑制剂腱蛋白结合，抑制骨形态发生蛋白信号通路[19]。此外，ECM蛋白本身也可以通过与细胞黏附分子如整合素[13]的相互作用，激活细胞内的信号转导，从而激活细胞内信号，调控细胞存活、增殖、形态发生迁移和分化等多种细胞功能[15,20]。

干细胞是组织工程和再生医学中很有前景的细胞来源。在干细胞分化过程中，转录因子的表达受细胞外微环境信号(如可溶性因子和ECM)的调控，研究者可以根据DECM促进干细胞定向分化的特性进行研究。Jang等[21]通过3D打印技术构建DECM补片进行心脏修复研究，发现DECM补片能够促进其中的心脏干细胞/MSC定向分化为新生血管以及促进心肌重塑。此外，软骨修复研究发现，软骨DECM能够为细胞提供三维环境，适合于MSC的附着、增殖和软骨分化[22-23]。Mao等[24]在对DECM支架的实验研究中也发现，DECM能够诱导和促进MSC定向分化为软骨细胞。同时，他们对于不同组织的ECM进行细胞培养，结果显示，来自软骨细胞的ECM促进了MSCs的软骨分化，来自成骨细胞的ECM促进了MSCs的成骨分化。这些研究表明，DECM能够促进干细胞分化，但不同组织来源的DECM在组成上具有特异性，因而可以诱导干细胞向不同组织和功能的细胞分化。

1.3低异物反应 异物反应是支架材料修复软骨缺损的影响因素。支架材料植入机体后，其表面抗原与机体抗体结合，促进生长因子、趋化因子及细胞因子等聚集，募集固有免疫细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)到损伤部位，形成肉芽肿，并逐渐形成瘢痕组织，最终完成损伤修复[25]。异物反应不可避免，但过度的异物反应会延迟组织愈合，增加瘢痕形成。特别是对于软骨组织，过度异物反应，瘢痕组织增加，不利于关节软骨修复，并影响关节功能。支架材料植入体内后引起的炎症反应与植入材料的类型有关[25]，因此有关支架材料的研究希望改变或控制上述因素，从而降低异物反应，达到组织修复的目的。DECM属于天然生物油墨，在此方面优势明显。研究显示，组织进行脱细胞处理后，移除了可能引起机体炎症反应或免疫介导的植入物排斥反应的潜在抗原[20]。这在临床试验中也得到证实，有研究者成功地将一个脱细胞的人供体气管移植入1例患有终末期支气管软化症的30岁女性体内。该患者未接受免疫抑制治疗，移植3个月后无异物反应[26]。

2 DECM的生物力学特性

一个好的软骨支架，不仅能为细胞提供良好生长环境，还要具备良好的生物力学性能。然而DECM材料作为3D打印制备组织工程支架还有很多不足，主要是打印出来DECM支架通常没有足够的机械性能[27]。有研究者用DECM支架修复关节软骨缺损，对脱细胞基质支架进行生物力学检测，结果显示其刚度明显小于正常软骨组织[28]。另一研究从脂肪组织提取DECM打印组织工程支架，并在体内成功进行软组织修复。但是DECM的溶解使其失去了原有的结构和机械强度[29]。因此，为了提高油墨的印刷性和组织功能，需要一种方法来调整DECM生物油墨的机械性能，目前主要通过改善DECM支架制备技术和支架材料的构成提高其机械性能。

2.1聚合物/DECM支架 用于构建DECM复合支架的聚合物主要分为糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)、丝素蛋白等天然高分子聚合物及聚己内酯(polycaprolactone, PCL)、聚乙烯醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)、PHBHOx等非天然高分子聚合物，它们具有良好的生物相容性和良好的机械性能，可弥补DECM支架机械性能不足的缺陷。Beachley等[30]用硫酸软骨素-N-羟基琥珀酰亚氨基琥珀酸酯对GAG进行修饰后制备GAGs/GAG支架，其机械性能明显增加。用丝素蛋白结合DECM制备的复合取向支架也显示出良好的力学性能，且成分与天然软骨相似，可以满足天然软骨对支架结构的需求[31-32]。同样，PHBHOx[16]、PCL[33]、聚乙烯醇[34]、PLGA[35]与DECM制备的复合支架不仅能够促进细胞黏附、增殖，同时机械性能较单纯的DECM支架明显提高，且随着复合支架中高分子聚合物比例增加，机械性能也明显提高。但有研究显示，非天然高分子聚合物(如PCL)降解周期长(> 2年)，可能对机体造成不良影响[33]。

2.2MSC/DECM支架 MSC是当前组织工程领域的研究热点，在软骨缺损修复方面，常用的干细胞为骨髓来源MSC和脂肪来源MSC。其主要优点为：①来源广泛，MSC存在于骨髓、脂肪组织、胎盘组织、牙髓、外周血及滑膜等组织中；②分离简单、培养成功率高；③具有成骨、成软骨、成脂肪细胞等多项分化潜能；④能够分泌多种细胞因子，参与免疫反应，具有免疫抑制特性。因此，MSC在软骨修复方面潜力巨大。有研究证实[11,36]，软骨DECM支架可以促进骨髓来源MSC或脂肪来源MSC分化为透明软骨，且机械性能明显提高。

2.3DECM支架制备技术改进 当前3D打印技术(如喷墨打印)构建的DECM支架不能满足软骨所需的生物力学性能，因此研究者对打印技术进行改进。下面列举两种支架制备技术。

2.3.1基于数字光处理的快速3D生物打印 数字光处理快速3D打印技术在医学领域研究较少。Ma等[37]开发出数字光处理的快速3D生物打印方法，并运用于肝脏DECM支架的构建，结果显示，肝脏DECM的支架不仅支持细胞活力，还提供稳定的生理学相关的机械环境。其主要优点为：①实现了生理相关几何形状的灵活设计以及对支架机械性能的精确控制；②通过改变曝光时间，可以在不改变支架组分的情况下易于控制刚度变化，从而消除由材料浓度或化学组成不同对细胞行为产生的影响。这种3D打印技术在组织工程支架制造技术中显示出了一定的优势，但该技术在软骨修复方面的研究还未见报道。

2.3.2冷冻干燥技术/3D打印 冷冻干燥技术和3D打印技术结合，能够精确构建宏观结构和微观结构相结合的组织工程支架，从而提高生物力学性能。Xu等[38]通过定向冷冻技术制备的DECM支架，不仅能够促进细胞生长和软骨再生，还具有定向显微结构和高力学性能。但是不同材料打印时所需参数不同，增加了打印难度与成本。

3 DECM支架材料在软骨缺损处的固定

支架固定是组织再生的关键步骤，但有关支架固定的报道较少。组织工程支架在软骨缺损处如何实现生物固定、功能整合，以及如何防止其在软骨缺损处移动，都是需要解决的问题。传统的方法主要为缝合固定和压合固定，但这些方法会造成固定困难、移位、手术时间长等问题。另外，多处缝合会导致软骨骨折或支架损坏，术后可能导致植入物降解、吸收[39]。针固定和销钉固定已被提出替代传统缝合方法[40-41]，与传统缝合技术相比，它们的极限失效载荷、屈服载荷和刚度显著提高[40]。但是，由于针固定和销钉固定技术对支架材料的生物力学性能要求较高，因此，这种固定技术不能使力学性能较低的支架在软骨缺损处得到有效固定。Döner[39]提出以2-氰基丙烯酸丁酯为软骨黏结剂，以促进基质植入，这种固定方式具有结合紧密、容易固定软骨移植物的特点，同时2-氰基丙烯酸丁酯具有生物降解特性，但目前临床上尚未推广。也有研究表明，生物相容性胶粘剂与压合技术相比并不能改善支架的固定[42-43]。有研究者制备了脱细胞软骨源性基质支架与磷酸钙基的复合支架，脱细胞软骨源性基质支架可以作为骨软骨插头,结合插入压合的方式,使支架复合物固定于软骨缺损基地部，避免了不安全的或复杂的固定技术引起的周围组织损伤[28]。随着跨学科研究的兴起，一种基于磁场力，将支架牢牢固定在植入位置的方法已经产生[44-45]。该方法通过磁力达到有效的支架固定，操作简单。但还有许多问题需要研究，如磁性材料，是否具有生物相容性、降解性，以及植入机体后的安全性问题等。

4 问题及展望

3D打印技术的发展，为软骨缺损修复带来了新希望，它可以根据受损部位的三维结构，设计出个性化组织工程支架。同时随着生物油墨材料的不断发展以及制备技术的改进，软骨缺损修复具有巨大发展前景。脱细胞基质材料作为生物油墨构建软骨支架，具备很大的潜力。它来源于自体组织，具备良好的细胞黏附、增殖及定向分化能力，同时生物安全性高，能够实现内在的细胞形态学和功能重建。但DECM机械性能差，不能满足关节软骨所必需的机械强度。虽然脱细胞基质与其他材料复合(如PLGA)构建的支架材料机械性能提高，但还存在一些较难解决的问题，如加大了材料的硬度，其韧性就会下降。对于支架复合物，如何能够在软骨缺损处可靠固定以及固定方式、固定材料的选择也是目前软骨修复方面需要进一步研究的课题。