线粒体膜通透性转换孔在细胞凋亡中的作用

金 曼，吴 娟综述，黎笔熙审校

0 引 言

细胞凋亡是细胞对环境条件变化产生的有序应答过程，该过程有助于维持细胞稳态，线粒体在其中扮演了重要的角色。线粒体俗称为“细胞的能量工厂”，主要通过产生ATP、维持线粒体膜电位（Δ ψm）稳定和释放凋亡相关因子来调控细胞［1］。在细胞凋亡机制中，线粒体膜通透性改变（mitochondrial permeability transition，MPT）是关键环节，其主要由线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）进行调节。当mPTP 开放增加，线粒体膜电位下降，线粒体膜通透性增加，线粒体内促凋亡因子，如：细胞色素c（Cyt c）、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）、线粒体促凋亡蛋白（SMAC/DIABLO、HTRA2/OMI、ENDOG）释放到细胞质中。本文将对mPTP 的结构模型及其各组分在细胞凋亡机制中的作用进行综述。

1 线粒体概述

线粒体是细胞内最重要的器官之一，它的损伤与多种疾病过程相关联，比如急性肺损伤、脑损伤、肝损伤等［2］。线粒体对内环境改变非常敏感，在凋亡早期即可发生变化。线粒体首先整合细胞内起始的凋亡信号，接着通过传递信号，可迅速改变细胞存亡状态［3］。研究认为线粒体由四个部分组成：外膜、内膜、膜间隙和细胞基质，其中致密的细胞基质被包裹在内膜内，内膜是线粒体的主要功能单元，它是电子传递链和ATP 合酶的组分，内膜可折叠成复杂的嵴，增加可用于氧化磷酸化的表面积，从而提高能量产生的效率［4］。线粒体外膜由“孔道蛋白”构成，它是几种蛋白质共同构成的整合蛋白，为高通透性，可允许小分子和离子自由通过；相较之下内膜为低通透性，几乎所有物质都需要跨膜转运蛋白才能进出，这种高-低通透性形成了Δψm，正常的Δψm 是维持线粒体正常功能所必需的。当线粒体受损伤产生应激或受到刺激后，线粒体内膜通透性可在短时间内迅速升高，一些平时不能通过的离子和分子得以穿过线粒体内膜，导致线粒体功能障碍，最终造成细胞的凋亡［5］。

2 MPT及其与凋亡的关系

研究发现，线粒体凋亡与其功能状态紧密相关，线粒体可在细胞内传递凋亡信号，如从细胞质到细胞核，而在这一传递过程中，MPT 起了重要作用［6］。MPT 的特征性改变为：线粒体大面积肿胀以及Ca2+超载［7］，研究发现，这种改变是由于一种孔道结构开放引起的，这种孔道结构即为mPTP［8］。在正常情况下，mPTP 仅容许相对分子质量＜1500 000 的溶质通过，当开放程度增大时会导致胞质中大量相对分子质量＞1500 000 的物质非选择性扩散入线粒体内膜，造成线粒体膜电位下降、呼吸链与氧化磷酸化解耦连、ATP合成减少［9-10］。大分子物质如蛋白质等穿过线粒体内膜进入线粒体基质，导致线粒体基质的胶体渗透压大大高于细胞质，于是渗透压较低的液体扩散进入线粒体，造成线粒体大面积肿胀，因为有线粒体嵴的存在，所以线粒体膜有很大伸展空间。此时在电镜下可见典型的线粒体基质密度降低、基质颗粒减少或消失，线粒体嵴变短、减少、边移。在失血性休克/再灌注损伤的动物实验研究中发现，MPT 的发生可以有两种结局：凋亡和坏死［8，11］。发生MPT 后的细胞会出现线粒体膜电位（Δ ψm）丧失，以及后续依赖线粒体膜电位的合成过程停滞，如ATP生成，ATP生成停滞、ATP耗竭、糖酵解ATP生成三者之间的平衡决定着细胞的命运［6，8］。

当受到各种损伤因子影响以及受体介导的刺激信号的干扰后，线粒体内可发生Ca2+蓄积，此外还有很多其他致凋亡途径，比如活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）途径等，但最终都归结于MPT。此外还有多种物质可导致MPT，如无机磷酸盐和苍术苷和羧基苍术苷［12］。

发生MPT 的线粒体会释放多种细胞因子，如Cyt-c、SMAC/DIABLO、AIF、HTRA2/OMI、ENDOG等。AIF 是一种线粒体黄素蛋白氧化还原酶，在细胞凋亡信号产生后，线粒体释放出AIF 和ENDOG，随后AIF、ENDOG 转移至细胞核，引起细胞核中的染色体凝聚和DNA片段化，从而导致细胞凋亡［13-15］。研究表明，MPT 抑制剂能有效改善细胞凋亡，减少典型凋亡现象出现，所以抑制MPT 可以起到对凋亡的限速作用。

3 mPTP结构模型

在20 世纪90 年代早期，基于纯化线粒体（即剥去外膜的线粒体）的电生理学研究证明，MPT 的出现是由于线粒体内膜的导电性显著增加，表明存在一个孔道结构促成这种电子交换。经过十余年的研究，现在普遍认为mPTP 是由多种蛋白质组成的复合蛋白通道，一般在病理情况下才会开放［12，16］。目前认为，位于线粒体内膜的腺苷酸转运体（adenine nucleotide translocase，ANT）、磷酸盐载体（phosphatic carrier，PiC）、金属蛋白酶、c 环内解耦连通道F1FO-ATP 合成酶［17］，以及位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion-selective channel，VDAC）和位于基质的亲环蛋白D（cyclophilin D，Cyp D）是mPTP 的基本组成部分［18］，基质 中 的Bcl-2 蛋 白 家 族、己 糖 激 酶I（hexokinaseI，HKI）等对其进行调节［19］。

4 mPTP各组成部分在MPT中的作用

4.1 ANT 与MPTANT是位于线粒体内膜上的小分子蛋白，属于线粒体溶质转运体家族（solute carrier，SLC25a），最开始研究者注意到ANT 是因为发现mPTP 的形成和开放都非常依赖ATP/ADP，由于ANT 是核苷酸中唯一的线粒体转位酶，因此它是能量产生和能量消耗过程之间最重要的联系。在体外ANT 重组系统中发现，ANT 具有通道活性，这与线粒体有通透性的假设相似。目前已知哺乳动物ANT 有3 个 亚 型，分 别 为ANT1、ANT2 和ANT3，ANT1 和ANT3 的作用是共同将线粒体基质内ATP和细胞质内ADP 进行交换，ANT2 是一种生长调节基因，已知在多种增殖细胞中高表达。ANT 的底物结合位点分为面向胞质的（c构象）和面向基质的（m构象），ANT 通过改变构象来调节mPTP 开关。当用可导致mPTP 开放的苍术苷进行实验时发现c 构象开放，而用可抑制mPTP 开放的米酵菌酸实验时发现ANT转向m构象［20］。

研究发现，同时敲除编码两种不同ANT 亚型（编码ANT1 的Slc25a4 和编码ANT2 的Slc25a5）的基因，仍能诱导鼠肝细胞发生MPT，并伴随Cyt-c 释放。进一步研究发现，从Slc25a4-/-Slc25a5-/-鼠肝细胞中分离出的线粒体在去极化剂的作用下会发生MPT，但对其应用苍术苷后并不产生MPT，由此可见ANT 或许参与不依赖mPTP 开放的细胞凋亡。诱导Slc25a4-/-Slc25a5-/-细胞mPTP 开放需要更高浓度的Ca2+，当用ROS 处理该细胞时，由于Bax 释放也会引起细胞凋亡，环孢菌素A（ciclosporin A，CsA）有一定保护作用。综上所述，猜测ANT 在mPTP 的形成和开放过程中主要起调节作用，而非关键作用［21］。

4.2 VDAC 与MPTVDAC 是阴离子通道蛋白家族，相对分子质量约33 000，位于线粒体外膜脂质双分子层中，离体重建纯化的VDAC 分子显示其能够形成二聚体通道，表现出与线粒体通道相似的通道活性［22］。VDAC 主要参与细胞能量代谢，在细胞质和线粒体膜间隙的物质运载中起桥梁作用，主要传递包括Ca2+、水、代谢物质和ADP/ATP 等在内的物质［23］。VDAC 在细胞质的核糖体中合成，由核基因编码，哺乳动物的VDAC 有3 个等位基因，分别为VDAC1、VDAC2、VDAC3［24］，当运用基因敲除方法去掉成纤维细胞等位基因VDAC1和VDAC3后，在Ca2+超载或Bax 活化时，这些细胞与野生型细胞一样会发生线粒体肿胀，甚至肿胀程度超过野生型细胞；至于VDAC2 缺失则会造成胚胎期死亡。另有研究发现，促凋亡蛋白Bax 导致的Cyt-c 释放在野生型小鼠和VDAC 基因缺失小鼠的线粒体内没有明显差异。综上，说明VDAC 并不是mPTP 的必要组成部分［25-26］。

4.3 Cyp D 与MPTCyp D 是核基因编码的相对分子质量为21 000 的亲环蛋白，具有肽基脯氨酸顺反异酶（PPIase）活性［27］。线粒体基质内编码Cyp D的基因是Ppif，敲除该基因可获得缺乏Cyp D 的Ppif-/-小鼠［28］。Ppif-/-小鼠的mPTP 对Ca2+过载诱导的mPTP开放有很大耐受性，对CsA（一种已知的mPTP开放抑制剂）不敏感。野生型小鼠和Ppif-/-小鼠对线粒体去极化、细胞基质pH 值、Cyt c 释放等反应结果类似。由此可见，敲除Ppif 后mPTP 仍能自由开放，说明Cyp D并非mPTP的必需成分，但是可通过促进ANT中Ca2+触发的构象变化来调节mPTP敏感性［29］，近年来研究表明，CypD可能与F1FO-ATP合成酶复合物的寡霉素敏感性蛋白亚基静电相互作用，以触发mPTP开放［17］。

4.4 PiC 与MPT有研究指出，缺乏ANT 同种亚型的mPTP 功能保持完整是由于线粒体载体家族其他成员发挥了补充作用，比如PiC［30］。哺乳动物线粒体内膜的PiC 由单个基因编码，作为线粒体Pi 穿过线粒体内膜的主要运载体，在ATP 合成中起重要作用。生理情况下，在合成ATP 时，PiC 催化细胞质中作为ATP 合成底物的Pi 进入线粒体，促进氧化磷酸化顺利进行，同时也参与一些磷酸化反应。既往研究显示，PiC 以CsA 敏感的方式调节Cyp D，所以CsA 可直接影响PiC 与Cyp D 的结合，已明确CsA 直接作用于mPTP，因此认为PiC 或许参与mPTP 的构成。研究发现，所有已知的mPTP 开放调节剂，都可以与此两种蛋白质结合，如苯基胂氧化物，N-乙基马来酰亚胺和泛醌类似物。另有研究发现，敲除PiC 基因能减少Cyt-c 的释放，减少凋亡［31］，然而也有研究显示敲除PiC 基因的线粒体，mPTP 仅显示出对激活剂的敏感性略微降低［32］，结合所有已知结果，与mPTP 的结构模型猜想一致，至少Ca2+过载、Cyp D 促进的PiC 变化、ANT 构象状态与mPTP 开放程度密切相关。

4.5 Bcl-2 蛋白家族与MPTBcl-2 蛋白家族凋亡调节因子主要参与调控线粒体外膜通透性，其促凋亡成员Bax、Bad和Bak和抗凋亡成员Bcl-2和Bcl-xL在线粒体膜上的平衡状况决定了细胞的存亡［33-34］。也有研究认为，Bax 和Bak 参与mPTP 的组成，尤其在病理情况下，理由是当遗传修饰后缺乏Bax和Bak表达的小鼠对诱导mPTP 开放的物质具有抵抗性。mPTP 与细胞能量代谢状态之间的关键联系由葡萄糖代谢的第一种酶—HK 调节。HK 有两个同种亚型，分别是HKI 和HKII，它们均对葡萄糖有高度亲和力，并且具有疏水性的NH2末端，因而可直接与线粒体外膜相接。HKII 从线粒体解离会引起细胞凋亡，机制是：HKII 和Bcl-xL 竞争性与VDAC 结合，当HKII 与VDAC 分离后，Bcl-xL 立马与Bax 解离转而与VDAC结合，被解离的的Bax与Bak结合形成线粒体外膜上开放的孔道，促凋亡蛋白Cyt-c 等能经过Bax-Bak 形成的孔道释放到胞质，使细胞发生凋亡。研究发现，在编码Bax 和Bak 基因遗传失活的情况下，线粒体外膜通透性下降而线粒体内膜通透性无显著改变，由此说明Bax 和Bak 不会直接调控线粒体内膜通透性，因此由Bax 和Bak 介导的细胞凋亡并不依赖mPTP 的开放［35］，而敲除VDAC 基因的小鼠细胞，HKII 从线粒体脱离仍能引起mPTP 开放和细胞凋亡，说明Bcl-2蛋白家族可直接调控MPT。

5 mPTP与细胞凋亡

有文献表明，mPTP 的开放程度由单个孔道开放时间以及单个线粒体上开放的孔道数量决定［36］。一方面mPTP 开放使电子通过线粒体内膜更加容易，导致线粒体膜电势和pH 梯度改变，线粒体功能障碍，合成ATP减少，同时使得ATPase酶活性改变，造成细胞质ATP 消耗增加，能量代谢被破坏。受能量影响最大的离子泵功能障碍，导致Ca2+失调，进一步加剧mPTP 开放［37］。另一方面，mPTP 开放使小分子物质，如辅酶因子、离子等可以穿越线粒体内膜，不仅造成线粒体与细胞质之间代谢物质的梯度不平衡，还引起线粒体基质肿胀。线粒体基质肿胀本身可以不引起线粒体内、外膜破裂，因为线粒体嵴可以延展开以扩大基质容积，但这会对线粒体外膜产生压力，当超过一定程度会导致线粒体内、外膜破裂［16，26］。研究证实mPTP 开放造成线粒体内膜通透性改变使得Cyt-c 从线粒体释放到细胞质［38］，Cytc 的释放是线粒体凋亡的重要信号，可激活caspase-3/9，从而诱导细胞凋亡的发生。

6 影响mPTP开放的因素

6.1 线粒体基质内存在的影响因子线粒体基质内调节mPTP 开放程度的关键是二价阳离子浓度，如Ca2+、Sr2+、Mn2+、Mg2+等。mPTP 开放需要线粒体基质内Ca2+超载，中和Ca2+能使其迅速关闭。Mg2+会降低mPTP 的敏感性，当腺苷存在时，此二种物质会产生协同效应。此外，可使mPTP 发生脱敏的还有Sr2+以及Mn2+，这是因为Sr2+、Mn2+、Mg2+等阳离子会影响线粒体基质内Ca2+浓度，甚至竞争性结合Ca2+结合位点。

6.2 pH 值mPTP 会受细胞基质pH 值影响，当pH值为7.4 时，是最适合mPTP 开放的。pH 值过高或过低都会大大降低mPTP开放程度［39］。

6.3 CsA 和Cyp DCsA 可 阻 止Cyp D 与ANT 结合，从而抑制mPTP 开放。既往认为敲除Ppif 基因或用其特异性抑制剂CsA 抑制mPTP 开放时［40］，必需有Pi 存在，然而最新研究表明不论Pi 是否存在，CsA均能抑制mPTP开放［41］。

6.4 线粒体内膜的稳定性线粒体内膜负电位有助于稳定mPTP 的闭合构象，当去极化时有利于mPTP 开放，因此当H+和K+进入线粒体内膜时促进mPTP 开放，线粒体内膜干扰剂可影响mPTP 开放，如两性阴离子有利于mPTP 开放，而聚阳离子、两性阳离子和正电荷肽不利于mPTP开放［42-43］。

7 关于mPTP在临床上的最新研究进展

大量的药理学和遗传学证据表明Cyp D 是唯一的、普遍接受的蛋白质修饰因子和mPTP 开放的关键调节因子。Cyp D 的PPIase 活性是调节mPTP 开放的关键。此外，调节性、非结构性相互作用使Cyp D 成为多种功能不同的蛋白质和潜在的mPTP 调节剂之间的信号传导中枢，如p53、补体C1Q 结合蛋白和β淀粉样蛋白。在线粒体外膜和内质网之间的交界处还发现了线粒体相关膜组分中的Cyp D，此处的Cyp D 位于VDAC1/Grp75/IP3R 复合物中，它正向调节内质网-线粒体Ca2+交换和线粒体Ca2+负荷，由此调控mPTP 开放。最新的研究模型提示Cyp D 与F1FO-ATP 合成酶的侧茎之间有功能性相互作用，与Cyp D 结合降低了F1FO-ATP 合成酶复合物的活性，当环境中有Pi 时可以使得mPTP 易被CsA 抑制，有人推测F1FO-ATP 合成酶复合物的寡霉素敏感性赋予蛋白亚基作为Cyp D 结合位点。鉴于Cyp D 敲除与线粒体对应激物耐受性增加之间的明确关系，Cyp D 通过直接抑制或调节蛋白质-蛋白质相互作用，代表了有效的治疗策略［44］。

7.1 直接抑制Cyp D 的临床药物目前直接抑制Cyp D 的最佳药物仍然是CsA，CsA 是一种疏水性十一肽和非选择性亲环蛋白抑制剂和免疫抑制剂，结合并阻塞亲环蛋白PPIase 活性位点，在心脏缺血再灌注损伤中mPTP开放的临床前模型中，CsA表现出狭窄的有效浓度范围，在浓度0.2 mmol/L 时观察到心脏保护作用，浓度高于0.4 mmol/L 时产生心肌毒性作用。这种狭窄的治疗窗通常会使离体心肌细胞的临床前研究变得艰难，并且会使临床使用复杂化［45］。

7.2 通过Cyp D 非依赖性机制作用于mPTP目前研究中使用的CypD 非依赖性抑制剂TRO-40303可与转运蛋白（相对分子质量为18000）的胆固醇结合位点结合。有研究表明TRO-40303 可在体外和体内再灌注损伤后延迟氧化应激诱导的mPTP 开放。在另一些小鼠的研究中，TRO-40303 在mPTP形成、调节或mPTP 介导的心肌细胞凋亡中没有作用。尽管如此，TRO-40303 仍进入了2 期临床试验，研究结果提示：在原发性经皮冠状动脉介入治疗前给予TRO40303 不影响促炎性细胞因子或急性期蛋白质的水平［46］。

8 结 语

mPTP 与细胞凋亡关系密切，目前人们对其结构组成、调控机制及实际功能等尚未完全了解，我们相信随着研究深入以及新科技的运用，一定会对其有更全面且充分的认识。抑制细胞凋亡是干预多种疾病进展的有效手段，目前比较明确的是通过抑制mPTP 开放可抑制细胞凋亡，因而积极开展可抑制mPTP 开放的干预措施有助于人类更好地预防和治疗疾病。