循环肿瘤细胞在卵巢上皮性癌中的研究进展

童 萌，刘 青

(甘肃省妇幼保健院妇科，兰州 730050)

卵巢癌是女性癌症死亡的第五大原因，据统计在美国，2017年卵巢癌的新发人数约22 440例[1]；在韩国，2004—2014年，卵巢癌的发病率从3.2/10万增加到4.8/10万[2]；而在我国，2015年约有52 100例新发病例，且有22 500例死亡[3]。而卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是卵巢癌的主要类型，占卵巢癌的90%以上，有显著的组织学和分子异质性。由于早期症状不明显，70%的患者发现时已为晚期，并伴有腹膜转移，且无论对治疗的初始反应如何，最终均可以观察到化学抗性[4]。EOC的治疗仍以肿瘤细胞减灭术+以铂类为基础的化疗为主，最新的治疗方法包括贝伐单抗和聚ADP-核糖聚合酶奥拉帕尼，但手术的局限性和患者对化疗药物耐药性的提高以及靶向药物使用的局限性，使患者的5年生存率普遍低于35%，而5年复发率高达80%[5]；相反，早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者的生存率高达90%[6]。因此，卵巢癌的早期诊断成为患者治疗效果及预后评估的重要影响因素。临床上常用糖类抗原125和人附睾蛋白4等肿瘤标志物对EOC的诊治效果及预后进行评估，但因其敏感性不高且缺乏特异性，故指导作用有限。近年来，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)的提出，为卵巢癌的早期发生、癌症进展和治疗提供了新思路。现就CTCs与卵巢癌的早期诊断、个体化治疗效果反应及预后评估的关系予以综述。

1 CTCs的概述

CTCs由Ashworth[7]于1869年首先提出；1976年，Nowell[8]将CTCs定义为来源于原发性肿瘤或转移性肿瘤，获得脱离基膜的能力并通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。CTCs体积大于外周白细胞，且核大，可见病理性核分裂象或多核巨细胞，在荧光显微镜下，4，6-二脒基-2-苯基吲哚、细胞角蛋白19呈阳性。Fan等[9]及Poveda等[10]的研究显示，CTCs同一细胞中会同时出现细胞核4，6-二脒基-2-苯基吲哚阳性的蓝染和细胞质细胞角蛋白19阳性的绿染。CTCs的分型包括上皮表型、间质细胞表型、上皮与间质混合表型及循环肿瘤微栓，Liberko等[11]的研究显示，CTCs的形成、迁移、侵袭与上皮-间充质转化及间质-上皮转化密切相关。CTCs是漂浮细胞群，其可从原发部位分离，并通过循环和淋巴系统传播到整个身体，对失巢凋亡具有抗性。CTCs被认为是转移的种子细胞，分离不需要任何侵入性程序。基于EOC的性质和位置，CTCs在EOC患者中的血液传播途径尚不清楚，同时酪氨酸激酶受体在EOC的CTCs形成中的作用尚未确定。近年来对CTCs的研究表明，从循环系统中捕获酪氨酸激酶受体阳性细胞是分离CTCs用于肿瘤细胞的基因组和蛋白质组学表征的有效方法[12]。因此，酪氨酸激酶靶向分离CTCs将有助于癌症治疗方法的设计，确定癌症患者对化疗药物效果的反应和耐药机制。但由于外周血中的CTCs从原发肿瘤流入脉管系统并以极低的浓度(仅占白细胞的1/106～1/107)在血流中循环，且在血液中呈现出很高的异质性，故CTCs检测技术仍然是一个挑战。

2 CTCs的检测

CTCs的检测过程可分为细胞的富集及鉴定，目前为止，已有多种技术用于EOC中CTCs的富集和检测，CTCs的分离或富集主要基于免疫磁性颗粒的大小，而CTCs的检测主要基于免疫细胞化学法。其中，基于物理特性使CTCs分离或富集的新技术，如用于分离和检测EOC患者CTCs的微流体装置已在研究中得到应用[13-14]；同时，基于微流体的ParsortixTM技术也已应用于CTCs的检测和富集。Nagrath等[15]用功能捕获技术成功富集了116例患者中115例转移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌及结肠癌患者外周血中的CTCs；同时，还有物理捕获技术，如ISET、Dean Flow Franctionation检测系统，也可富集外周血中的CTCs；此外，Katarina等[16]使用抗体捕获技术分别对卵巢癌、子宫内膜癌及宫颈癌患者进行CTCs富集。富集分离后的CTCs需进一步鉴定，目前常用的方法有免疫荧光标记、RNA原位杂交、染色体核型鉴定等，它们可以对细胞形态学、免疫学及分子学等进行测定，以实现对CTCs的定性及定量分析[17]。其中，免疫标记法是最常用的方法，其利用上皮细胞的特异性抗体，对一种或多种抗体染色，从而鉴定出CTCs。常用的卵巢癌特异性抗体有细胞角蛋白、上皮细胞细胞黏附分子、切除修复交叉互补蛋白1、亲环素C及叶酸受体α等。临床上，研究者可以根据以上不同的卵巢特异性抗体，对CTCs做出选择。食品药品管理局采用依赖抗上皮细胞黏附分子对CTCs进行选择，并公布当外周血CTCs≥2个/7.5 mL时为CTCs阳性，这种方法主要用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌。然而，由于CTCs在上皮-间充质转化过程中可导致上皮细胞黏附分子表达下调，故会影响CTCs的捕获。Po等[18]利用基于神经钙黏素的流式细胞仪检测了卵巢癌患者的卵巢癌细胞系，结果表明单独基于神经钙黏素分离出的CTCs是单独使用上皮细胞黏附分子离出CTCs的2.1倍。Tsai等[19]首次采用新型微流体系统以卵巢癌CX-BG1-10-A适体包被的磁株为特征来捕获血液的CTCs，此方法获得的CTCs中白细胞明显减少，且假阳性率较CellSearch检测方法低至少两个数量级，故其成为一种有前景的检测手段。而Obermayr等[14]为了提高CTCs富集的纯度，开发了一种富集CTCs的工作流程，即结合密度梯度离心和浓缩、ParsortixTM微流体技术及实时荧光定量测定聚合酶链反应分析的方法，消耗CTCs中约106污染的白细胞，从而为临床研究中CTCs的检测和分子表征的探索进一步提供了可靠的理论依据。

3 CTCs在卵巢癌早期诊断中的价值

目前，血清糖类抗原125和人附睾蛋白4是评估卵巢癌最常用的标志物，但由于两者单独检测缺乏敏感性和特异性，CTCs的检测为患者提供了一种更为方便、无创及精准的检查方法。有研究显示，在500例卵巢癌Ⅰ期患者中，血清糖类抗原125的阳性率(65%)明显低于CTCs，且卵巢癌早期(Ⅰ期、Ⅱ 期)的检出率(82%和85%)明显低于晚期(Ⅲ 期、Ⅳ期)(91%和100%)(P<0.05)，证明CTCs的增加与癌症进展相关[20]。Ried等[21]研究比较了CTCs计数与癌症的状态和风险，结果表明CTCs筛查检测EOC的敏感性较高，且CTCs计数越多，则为恶性肿瘤的可能性越高。随着时间的推移，CTCs的检测也可用于评估治疗的有效性。Pearl等[22]分离了129例术前卵巢癌患者的侵袭性循环肿瘤细胞(invasive circulating tumor cells，iCTCs)，结果显示iCTCs在卵巢癌早期(Ⅰ～Ⅱ 期)患者中的特异度和阳性预测值均高于糖类抗原125(98.1%比76.2%，77.8%比61.6%)。Guo等[23]及Suh等[24]的研究显示，CTCs诊断早期卵巢癌的敏感性高于血清糖类抗原125。Gostner等[25]研究发现，在早期诊断中卵巢癌患者的CTCs状态与免疫系统功能也相关，如在CTCs阳性患者中，与免疫系统相关的生物标志物(新蝶呤、色氨酸及犬尿氨酸)水平均显著升高。上述研究表明，CTCs检测在区分卵巢良恶性肿瘤和早期卵巢癌的诊断中发挥重要作用，且在很大程度上提高了EOC早期诊断的敏感性和特异性。

4 CTCs在卵巢癌精准治疗中的应用价值

卵巢癌治疗过程中化疗药物耐药性的提高及生物靶向治疗的进展使得CTCs在卵巢癌的个体化治疗中呈现出独特的应用价值。Aktas等[26]研究发现，卵巢癌患者中CTCs表面的肿瘤抗原或分子标志物可作为生物靶向治疗的靶点。而Obermayr等[27]利用聚合酶链反应对CTCs进行了检测，鉴定了卵巢癌CTCs的新基因标记，包括细胞周期素2基因、缺氧诱导基因、肿瘤相关膜蛋白2基因、T细胞分化蛋白2基因、酵母蛋白C基因和神经递质转运蛋白8 基因六种，其中酵母蛋白C基因阳性的CTCs患者更可能出现铂类药物耐药。Craescu等[28]研究指出，酵母蛋白A基因为免疫抑制药物环孢素A的受体；随后Lee和Kim[29]的研究证实，酵母蛋白A基因具有逆转铂类化学抗性的巨大潜力，其在各种癌症中表达上调，与癌症的恶性转化密切相关。而Zhang等[20]的研究显示，血液CTCs数量随着治疗方法的变化而变化，且CTCs中上皮细胞黏附因子和人类表皮生长因子受体2的表达与化疗的耐药性相关。Katarina等[30]使用MetaCell技术通过基于荧光显微镜的细胞形态学评估结合相对基因表达分析来检测CTCs，发现人角蛋白7基因、白血病基因、上皮细胞黏附分子基因、Mucin16、Mucin1、牛角蛋白18 和牛角蛋白19基因的表达差异有统计学意义，故得出根据不同基因的表达可以检测出EOC患者中CTCs的表达情况，这些基因在作为辅助卵巢癌早期诊断潜在生物标志物的同时，也可预测卵巢癌的治疗反应。

5 CTCs评估卵巢癌预后及复发的价值

EOC的转移存在于所有实体恶性肿瘤中，包括腹膜腔内肿瘤细胞球体利用腹水转移和血行转移两种途径。血液中的CTCs不仅可以更好地了解肿瘤转移的生物学特性和评估肿瘤的治疗效果，还为治疗后的反应提供了科学依据。同时CTCs不仅可以作为参与卵巢癌血行转移的途径，也有评估预后或预测生物标志物的作用。Caixeiro等[31]的研究表明，血液中高水平的CTCs与结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌的疾病进展与预后相关。而有荟萃分析显示，卵巢癌患者CTCs阳性计数与患者的总生存期、无进展生存期及卵巢癌的分期相关[32-35]。莫美绒等[36]采用CellSearch系统检测了56例卵巢癌患者术前血液中的CTCs，结果显示，CTCs阳性计数与肿瘤的分化程度、分期、淋巴结是否转移及复发情况独立相关，且CTCs阳性组患者5年生存率低于阴性组(47.62%比91.43%，P=0.032)。Pearl等[22]研究表明，iCTCs阳性的EOC早期患者的总生存期和无进展生存期与晚期患者比较差异均有统计学意义；同时，iCTCs阳性计数≥5个/mL患者的总生存期和无进展生存期均明显低于iCTCs阳性计数<5个/mL的患者。此外该研究发现，在不同肿瘤分期、残余病灶的大小及对铂类化疗药物敏感的患者中，与糖类抗原125相比，iCTCs在判断患者的总生存期和无进展生存期方面准确性更高，提示iCTCs阳性计数的升高与预后不良有关。一项针对2 000例EOC患者血液中CTCs的存在能否显示微小残留病灶的研究表明，CTCs阳性患者的总生存期较CTCs阴性患者短[37]。Obermayr等[37]的多中心研究显示，在术后经过标准6个月化疗的患者中，存在缺氧诱导基因且CTCs阳性患者的无病生存期及总生存期均短于缺乏缺氧诱导基因且CTCs阳性的患者，表明患者的CTCs状态与无病生存期和总生存期紧密相关。Chebouti等[38]在基因水平研究了卵巢癌患者手术前和铂类药物化疗后上皮-间充质转化的CTCs发生率，而与上皮-间充质转化相关的转录物包括磷脂酰肌醇-3-激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白-2激酶，结果表明磷脂酰肌醇-3-激酶阳性的CTCs患者总生存期和无进展生存期显著降低，且在手术后有残余癌灶的患者中，可以观察到上皮-间充质转化样CTCs。上述结果均表明，CTCs的计数及状态在评估卵巢癌预后方面有显著优越性。

6 展 望

CTCs是肿瘤细胞，其与原发性肿瘤分离并进入血流。CTCs不与细胞外基质结合，且其由于失巢凋亡的抗性而在血流中存活，每107个血液元素大约存在1个肿瘤细胞，比较罕见。由于CTCs具有监测创伤性小、可连续监测等特点，故可为卵巢癌的治疗和预后提供相关信息。细胞角蛋白、上皮细胞细胞黏附分子、切除修复交叉互补蛋白1等均为卵巢癌CTCs的分子标志物，这些分子标志物为卵巢癌的早期筛查、精准化治疗、复发和转移的判断、寻找耐药性的原因、评估卵巢癌术后或放化疗的疗效及预后提供了重要的理论依据。此外，CTCs的检测为更好地理解细胞间的相互转移提供了依据，对抗性遗传改变的实时检测过程提供了良好的参考价值。但由于可用样品的量有限，缺乏统一检测方法、参考标准及费用昂贵，CTCs的检测仍具挑战性，故其在临床妇科肿瘤方面尚未广泛应用。针对目前CTCs的分离、富集与鉴定方法仍不能满足临床工作的需要，故未来需进一步提高CTCs检测的敏感性和特异性，从而提高CTCs对卵巢癌的早期诊断价值；同时，希望以后有更多大规模的前瞻性研究来提高CTCs的生物学特性，以支持CTCs在卵巢癌的个体化治疗和预后评估及复发方面的临床价值。