微渗漏检测方法的研究进展

方玉叶，吕长海

(昆明医科大学附属口腔医院儿童口腔科，昆明 650106)

完善的根管治疗需要良好的冠方及根方封闭，可防止根管与根尖周之间组织液的微循环以及口腔内细菌的渗入与根管内残留细菌的影响[1]。微渗漏指充填材料与牙体间或充填材料自身的微小间隙使口腔内微生物及其代谢产物、化学物质、液体、分子或离子等渗入，微渗漏的深度可至窝洞的底部，从而引起过敏反应、继发龋、牙髓刺激和边缘染色等[2]。牙体组织与充填材料不密合可导致微渗漏的发生，是根管治疗失败最主要的原因，且冠方微渗漏较根尖微渗漏更容易导致治疗失败[3]。此外，临床医师的操作充填技术、密封剂的理化性能和玷污层的去除程度等因素对微渗漏也有较大影响。

目前，微渗漏检测大多通过体外研究观察。常用的检测方法有染料渗漏法、染料提取法、流体滤过法、电化学法、微生物渗透法、葡萄糖渗漏法、放射线同位素、扫描电子显微镜、微型计算机断层X线扫描等[4]。但关于封闭剂封闭能力的研究尚未达成共识，现对近年来微渗漏检测方法的研究进展予以综述。

1 染料渗漏法

染料渗漏法由Grossman提出，指将特定染料经某种方式渗入需要检测的目标物体中，通过对染料的观察评价目标物体微渗漏情况，操作简单，是目前最常用的体外检测方法[5]。封闭根尖2 mm以上的牙体后，根尖浸泡于染料内，染料通过根管壁与充填材料或充填材料本身的空隙渗漏，这是一种在常规大气压力下进行的被动染料渗漏法，可采用纵向剖开、横向剖面和透明牙法，用线性方法观察染料的渗漏深度[6]。常用的染料有伊红、亚甲蓝、印度墨水、碱性品红、龙胆紫、荧光染料、硝酸银等[7]。

纵向剖开和横向剖面是从二维角度观察渗漏情况。纵向剖开是在立体显微镜下观察渗漏深度，受试验者的主观影响；随机选择剖开面，通过染料渗透最深点的概率极低，导致低估渗漏。横向剖面只能确定每一节是否有渗透，以上两种方法由于技术本身(锯片厚度)会造成牙本质组织和染料的部分丢失[6]。

透明牙法是通过10%硝酸脱矿、不同浓度乙醇溶液脱水和水杨酸甲酯浸泡的过程使牙齿变透明，以便提供根管内部解剖结构的三维图像，其优点是没有牙体组织损失，更清晰地观察侧副根管渗漏区域及充填材料与根尖孔的关系[8-9]。若脱矿脱水不完全会降低牙齿的透明度，牙齿长期浸泡在硝酸、乙醇等酸溶液中可引起染料溶解。

被动染料渗漏法中根管充填材料间隙内空气会阻碍染料渗漏，故出现了真空或离心状态下的主动染料渗透法[4]。但有研究表明，染料更容易渗漏到无水空隙，故主动染料渗漏法的渗漏明显高于被动染料渗漏法[10]。染料渗透法是一种定性实验，因具有较好的敏感性、易用性、便利性和成本效益而应用广泛[11]。但由于扩散现象不能立刻得到结果,故需对样本进行破坏性分析，不能重复实验。

2 染料提取法

染料提取法是基于染料渗漏法的一种定量实验，除根尖以外的牙体组织被封闭，在正常大气压下，浸泡在染料内48～72 h，流水冲洗30 min清除牙体表面的封闭材料，放入酸性溶液(如65%硝酸)3 d，释放出界面所有染料，再将液体置入离心机离心(14 000 r/min，5 min)[12-13]。基于每种物质特有的吸收光谱，不同染料对光的选择性吸收波长及相应的吸收系数是固定的物理常数，应用分光光度计进行光学密度分析，取离心后的上层均一溶液，测定出溶液中染料对光的吸收度，从而计算出染料的含量[14]。亚甲蓝、甲苯胺蓝、碱性品红分子大小与细菌毒素相似，常用吸光度法测定[15]。染料提取法操作简单，不需要昂贵的设备，但溶液中的杂质及温度变化等均可影响测量结果。

3 流体滤过法

流体滤过法通过气泡在微量管内的位移距离计算微渗漏，经改造用于根管微渗漏的测量，样本冠方与大气压下装满水的管道连接，根尖与带刻度的微量管相连，由冠方向根尖施加恒定的压力，当样本存在间隙时，水通过间隙使微量管中气泡发生位移，根据记录的位移距离及流体动力源公式计算微渗漏[16]。目测观察位移存在一定误差，现采用计算机控制和数字气压设备，基于光的折射反应通过计算机控制的激光二极管观察气泡运动[17]。

流体滤过法是定量实验，不破坏样本，不需要示踪剂，消除了分子大小、与牙本质亲和力或pH等有关因素的影响；可在不同时间反复测量，通过改变施加压力或微量管直径来调节系统灵敏度，但不能反映微渗漏发生的位置[18-19]。测量时间、施加压力、含气泡管的直径、气泡长度等没有标准化，可能导致实验结果不同[20]。长时间高压会导致样本新的间隙形成[21]。染料提取法与流体滤过法都考虑到材料的多孔性，实验结果存在一定相关性，但流体滤过法测量时，液体可在空隙中达到平衡，使滤过减少[22]。

4 电化学法

金属与腐蚀性物质接触，可通过电极反应(一种电化学反应)发生腐蚀。Jacobsen和Fraunhofer[23]依靠离子在空间内扩散进行了电化学微渗漏实验，将除冠部和根尖牙体外都封闭，冠部和根尖被分别浸泡在两个独立电解质溶液中，将电解质中的电极与稳压器连接，用电流计测量通过充填材料的电流，根据欧姆定律得出样本阻抗。微渗漏大小与阻抗值成反比、与电流大小成正比，电流大小与电解质与电极的接触面积成正比[24]。

稳压器分为直流稳压器和交流稳压器。应用直流电灵敏度有限，且可产生极化效应，只有电解质扩散到整个界面时才能进行记录测量，且不能用于测量冠部密封缺损样本；而交流电连续测量时不产生极化效应，低值电位(40 mV)对牙体内部电荷分布不产生干扰，封闭后可立刻测量电流值，此方法敏感，较常使用[25]。

电化学法是一种定量实验，无损样本，可长时间对同一样本进行多次测量，并可评估热循环、老化、机械应力等对牙齿与充填界面的影响[25]。但电解质的组成、电极类型及各电极之间距离、电极厚度等会对实验结果产生影响；电极上腐蚀沉积物的积累阻碍离子流动扩散，影响电流值的准确表达[26-27]。测定样本的充填修复体只适用于非金属材料，而对于金属材料的结果并不准确[28]。

5 微生物渗透法

人体口腔是个复杂的微生态环境，存在种类繁多的天然菌群，各部位微生物群体差异很大，细菌微生物较染料等物质更能体现临床相关性，故Goldman等提出微生物渗漏法[29]。检测微生物渗漏主要有双室渗漏模型、扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)及聚合酶链反应3种方法。最常用的是双室渗漏模型，实验前对渗漏装置进行消毒，充填物冠方是含细菌的培养液，根尖是无菌培养基，封闭除根尖2 mm外的牙体，无菌培养基变浑浊则表明发生微渗漏[30]。在SEM和聚合酶链反应中，可直接在根管或牙本质小管中观察到或检测到细菌[31]。对目标微生物检测具有较高的特异性是聚合酶链反应技术的最大优点，也适用于封闭前根管内有细菌残留的情况[32]。

常见的示踪菌有粪肠球菌、变异链球菌、表皮葡萄球菌、产黑普氏菌、嗜酸乳杆菌、齿状放线菌、荧光假单胞菌、具核梭杆菌、白色念珠菌等，可以是单一细菌或混合菌群，但结论因细菌种类不同而不同。粪肠球菌是最常用的示踪菌，它是正常口腔的菌群组成，也是根管内最常见的微生物，常合并需氧和厌氧菌感染[33]。利用唾液进行微生物泄漏实验，可以刺激根管内残留细菌的生长繁殖，更好地模拟单一细菌或混合菌群渗漏的临床环境，但不能模拟温度和唾液流动等变化[34]。

微生物渗透法是一种定性实验，较好地模拟了临床和生物环境，细菌微生物的大小、生物活性都与口腔病理生理活动相关；细菌不能到达的微小空隙，其产物可以渗入，且细菌产物可早于细菌进入根管系统。只要有一种细菌通过封闭的根管就会在培养基中繁殖引起浑浊，且不能估计根尖感染时间；此外，具有抗菌性能的材料(如丁香酚糊剂)不能用微生物法测定微渗漏[5]。

6 葡萄糖渗漏法

葡萄糖具有亲水性和化学稳定性，是细菌微生物所需的营养物质，分子量很小(重均分子量为180)，可使根管内残留的细菌繁殖，有较好的临床相关性[35]。Xu等[20]用葡萄糖作为示踪物来分析根管微渗漏，充填物冠方是葡糖糖溶液，通过静水压力使葡萄糖分子渗入根管，抽取根尖区溶液，用分光光度计测量滤过根管的葡萄糖含量，通过葡糖糖氧化酶-过氧化物酶法得出葡萄糖浓度，从而算出不同时间间隔的微渗漏。分光光度计检测值在0.02～1.2(相当于葡萄糖浓度0.6～79.6 mg/L)，低于最低值将被忽略，超过最高值将无法检测[36]。有报道用分光光度计和葡萄糖试纸得出的葡萄糖浓度平均值相似，两者之间存在相关性，葡萄糖试纸费用较低，是检测葡萄糖渗漏值的有效方法[37]。

葡萄糖渗漏法是一种定量实验，能够连续无创测量微渗漏，具有成本低，特异度和灵敏度高的特点，且不受观察者主观因素影响[38]。但操作中存在较难维持无菌状态、葡萄糖水分消耗和蒸发、葡萄糖可能渗漏到牙本质而非根尖等问题。有研究表明，葡萄糖在碱性环境下可转化为不能被检测的葡萄糖酸盐，根管充填材料sealer 26及矿化物三氧化物凝聚体含有氢氧化钙，根管消毒时残留的氢氧化钙会影响实验结果，不适合用葡萄糖渗漏法，故有学者提出用蔗糖代替葡萄糖作为示踪物[39-40]。

7 放射性同位素

放射性同位素是将含同位素的溶液放置在充填材料冠方，可定量测量根尖渗出同位素的放射活性，常用的示踪剂有14C、45Ca、131I、32S、22N、99Tc等。γ计数器具有较高的灵敏度和特异度，可以精确地计算出放射性物质的剂量，直观反映出微渗漏的大小，测量时不受操作者的主观影响。放射性同位素颗粒约为40 nm，最小的色素颗粒为120 nm，细菌的大小为50～1 000 nm，具有高度的穿透性，可以提供更精确的微泄漏量信息[41]。但有研究表明，同位素45Ca与牙齿和部分修复材料有亲和力，且能渗入其中，并导致测量误差[26]。放射性同位素具有较好的重现性和较高的准确性，但相同材料的形状和表面纹理不同可影响放射性同位素的黏附程度，导致测量结果不同；测量时需要精密的材料和仪器，具有放射性损害，目前较少使用[18]。

8 SEM

SEM是检测和分析实体对象最常用的工具，通过聚焦电子束向样本发射电子，依据电子与样本中原子的相互作用，检测样本中发射的次级电子，探测体收集次级电子后，转化为不同强度的电信号，可获取被测样本的各种理化性质信息，形成完整的图像[42]。

SEM是一种定性方法，常与染料渗漏法结合用于观察渗漏的程度。采集速度快、放大倍数大，图像分辨率高，样本损伤和污染程度小，可从多个角度同时对样品表面进行三维成像。但需要特殊的设备和真空条件，检测前样本需脱水和干燥，否则可能导致充填材料间产生裂隙，影响微渗漏。

9 微型CT

微型CT是一种三维成像方法，其分辨率与光学显微镜相当，已应用于口腔领域。随着微型CT技术的发展，现可用于检测裂缝及微渗漏[43]。临床上，微型CT的分辨率(体素<0.001 mm)较CT及磁共振高(体素0.7 mm)，可更好地描述较小结构，并对三维数据集进行处理，以建立精确的解剖模型[44]。

扫描仪X射线垂直样本，用光敏探测器记录未吸收的光子信号，利用图像分析软件将辐射不透明度转换为灰度值，最终成像取决于材料原子序数和质量密度，高于阈值的灰度值自动转换为“白色”，而低于阈值的灰度值被转换为“黑色”。如果组织间密度相似，将很难视觉识别，则需要浸泡或注射造影剂[45-46]。

微型CT结合三维重建技术可定量微渗漏，并立体重现微渗漏形态；定位准确，可在干预前后进行评估，测量充填材料中的间隙体积，同时保持样本完整性。但微型CT的测量精度(1.8 μm)较电子显微镜(0.25 μm)低，需要特殊仪器辅助操作，测量的时间和成本较高[47]。

10 小 结

随着科学技术的发展，各种新技术和新设备的出现对口腔和临床医学的发展起重要作用。在口腔临床实践中，紧密密封根管非常重要，目前关于微渗漏的检测方法较多，由于尚无不同检测方法的统一标准，且受观察者主观因素的影响，故使用同一种检测方法结果也存在一定的差异，从而干扰研究的最终结果。微渗漏检测方法基本均在体外进行，以人类离体牙为样本，模拟临床封闭操作，故实验结果与临床有一定的相似，但人类口腔内环境多变，充填材料受食物温度变化、咀嚼力等因素影响，其中热因素对微渗漏的影响最大，故不能完全模拟口腔内微生态的环境变化。因此，进一步研究微渗漏实验的临床相关性及不同微渗漏检测方法之间的可靠性和相关性，更好地将不同方法结合，从而得到较为准确的结果，对提高临床治疗效果具有重要意义。