miR-132/212在AD相关认知功能障碍中的研究进展

陈盼盼，齐玉英，郑海非，杨红彦，王雪贞，b※

(滨州医学院附属医院 a.神经内科，b.代谢与神经精神疾病研究所，山东 滨州 256603)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和精神行为损害为特征的中枢神经系统疾病,其病理改变主要有认知功能脑区广泛的神经元减少或丢失、细胞内神经纤维缠结和细胞外淀粉样斑块(老年斑)形成。据统计，全世界AD患者有2.4亿，预测2050年，AD患者可达9.6亿[1]。65岁以上的老年人发病率为5%～10%[2]，随着年龄增长，AD的患病率逐渐上升，AD造成的社会和家庭负担日益加剧，然而AD所致的认知功能障碍及其病理变化的分子机制目前尚不清楚。阻碍有效治疗发展的原因是缺乏疾病早期诊断的特异性标志物，因此找到疾病早期的特异性标志物并进行早期干预尤为重要。研究发现在痴呆甚至轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，MCI)诊断前的10～20年脑内就已出现显著改变，如Tau蛋白过度磷酸化的神经纤维缠结[3]。近年来，微RNA(microRNA,miRNA)已经成为多种疾病的新型标志物。其中miR-132/212在神经突触可塑性、轴突生长发育和记忆等方面发挥重要作用，其减少可导致β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)产生及Tau蛋白磷酸化。现就miR-132/212在AD发病机制中的作用作一综述，为AD的治疗提供新的治疗策略和理论基础。

1 miRNA及其成员miR-132/212

1.1 miRNA miRNA是一类含有22个核苷酸长度的非编码RNA，调节转录后蛋白表达，在大脑中丰富表达，每个miRNA可以针对多个转录基因，潜在地作用于多种生物途径[4]。miRNAs通过结合到RNA结合蛋白或囊泡，如外泌体和微泡的体液运输释放到细胞外环境，结合到它们的目标信使RNA 3′端未翻译区的补充位点，导致mRNA裂解或抑制翻译。miRNAs作为MCI和AD潜在的生物标志物，可以区分AD或MCI与健康对照组，且有较高的准确性。miRNAs在发育、代谢、神经可塑性、压力反应和生存方面发挥重要作用。有研究在斑马鱼的Dicer基因上进行了敲除实验，结果导致大脑形态发生缺陷，说明miRNA对大脑发育的影响至关重要[5]。多项研究结果表明，特定miRNA的表达从AD早期阶段就受到异常调节，这些分子控制着疾病的多种目标基因和关键信号通路改变，可能最终调节细胞死亡机制[6-8]。在特定系统中，miRNA的组成和细胞特异性表达对其特定的生物功能负责，在不同生物体液(血液、脑脊液和尿液)中，miRNA的表达表现出它们的临床相关性和多功能性，它们均是疾病的潜在调节剂和可使用的生物标志物。miRNA在所有生物的组织中表达，表现出细胞或组织特异性，其表达可以是暂时的空间上的调节。Landgraf等[9]对不同组织中的miRNA进行了第一次和最全面的分析，分析了特定组织表达，miR-9、miR-124、miR-128A/B在大脑表达，miR-122在肝脏表达，miR-142、miR-144、miR-250、miR-155、miR-223在造血细胞表达。这种特异性表达对认识疾病的进展至关重要，不同的生物体液中miRNA水平变化与不同的疾病有关，因此，可将miRNA作为细胞外生物标志，用于诊断和预测人类疾病。miRNA是一种具有高临床潜力的万能分子，因为同样的miRNA可以结合几个不同的靶点并控制整个信号通路，使它们成为神经退行性疾病的相关治疗和(或)目标分子。外周血miRNAs是理想的生物标志物，因此越来越多的研究开始探索其在AD中的作用。

1.2 miR-132/212 在miRNA中，miR-132/212与神经退行性疾病相关，包括AD、亨廷顿病及前额叶痴呆[6]。有研究分析了miRNA作为MCI或AD外周标志物的诊断价值，在10项AD研究中，与控制组相比，AD患者20种miRNAs显著上调，32种miRNAs下调，9种miRNAs一致调节异常[10]。在3项MCI研究中，miR-132被发现是一致上调的，miR-132在AD中显著下调。miR-132/212的种子序列相同，表明它们管理一组共同的目标，miR-132/212簇集位于人类第17号染色体上(小鼠第11号)[10]。

2 miR-132/212与认知功能和AD

2.1 miR-132/212在认知功能中的作用 研究证明，miR-132/212是大脑中最丰富和最主要的功能物种，多项证据支持miR-132/212在神经功能中的作用，包括树突和轴突生长、突触可塑性、神经元的可塑性、记忆形式[11-12]。miR-132在小鼠大脑中的过表达会导致小鼠在新物体识别实验中用在新物体的时间减少，表明必须严格控制miR-132的水平[13]。与学习记忆有关的几个参与者，如环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein-2，MECP2)、BDNF和CREB控制miR-132/212转录，而MECP2是miR-132/212的直接目标[14]，免疫印迹分析显示MECP2在大脑皮质中显著减少，在海马中有较低水平，海马磷酸化CREB增加，BDNF下调，而大脑皮质没有发现这些变化[15]。在水迷宫和巴恩斯迷宫中miR-132 KO小鼠存在空间记忆和学习缺陷。miR-132/212的先天缺乏与空间记忆、学习和记忆回忆的缺失有关，这与早期miR-132敲除的研究相一致[15]。MECP2在miR-132/212缺乏时下调，尽管有学者认为在没有miR-132/212的情况下MEEP2会增加[16]，但在之前的研究[15,17]中，miRNA与它们体内的目标之间的正相关关系已得到证实，增加CREB的磷酸化与空间学习改善有关[18]。海马体在学习和记忆中具有重要作用，在啮齿类动物认知行为实验中，如巴恩斯迷宫会导致海马区miR-132/212显著增加。对培养的神经元给予化学或电刺激也会导致miR-132的快速升高。活性诱导miR-132/212的表达有助于记忆形成，研究证明miR-132/212促进新生神经元树突生长，miR-132对小鼠齿状回新成熟神经元兴奋性神经回路功能的完整性起重要作用[19-20]。敲除小鼠海马miR-132/212可减少各种刺激下诱发的树突长度、形状及树突棘的大小，而在海马和皮质神经元异位表达促进树突生长。同样,在小鼠海马敲除miR-132/212会减少CA3和CA1神经元之间的突触传递，改变长时程增强动力学，长时程增强被认为是学习和记忆的关键细胞事件。

2.2 miR-132/212在AD及AD神经病理中的作用和机制

2.2.1 miR-132/212在AD神经病理中的作用 在最初报道的AD患者的海马体中，miR-132水平并没有改变，但有证据显示在AD患者的大脑中miRNA下调[21]。在痴呆前期患者的海马体、颞叶和前额叶皮质表现出miR-132下调。在AD中，miR-132/122水平与Tau蛋白病理学的严重程度相关，而miR-132和Tau则在同一神经元群中共同表达。与年龄匹配的对照组相比，12月龄3xTgAD能同时产生淀粉样斑块和神经元纤维缠结的动物模型小鼠Aβ40/42水平增加，在18个月时，所有Aβ增加，Aβ42增加了10倍，因此，miR-132/212的丢失促进Aβ的生产、累积和沉积[22]。5个验证过的miR-132下游目标有3个已经证明在代谢或病理上的作用，包括Sirt1、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和Tau。研究发现，与对照组相比，内源性Sirt1和Tau在3xTgAD小鼠中上调，说明miR-132/212缺乏促进Tau的发生[7,23-24]。Sirt1可以对组蛋白、非组蛋白和其他转录因子进行脱乙酰化，并参与调节许多生理功能，包括细胞衰老、基因转录、能量平衡和氧化应激。Sirt1功能障碍与神经性疾病有关，特别是AD，Sirt1的影响可能作用于Aβ的上游和下游[25-26]。Sirt1的活性也被证明与Tau病理有关[27]。研究证明Sirt1对小鼠正常学习、记忆和突触可塑性是不可缺少的[26]。

2.2.2 miR-132/122在AD神经病理中的机制 另一个miR-132下游目标是MAPK1/胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)2，ERK/MAPK的异常调节与Aβ诱导的下游信号事件有关[25]。然而，ERK/MAPK也可以通过调节β分泌酶1在 Aβ生产的上游运行[28]，ERK在调节Tau磷酸化中也有一定作用，除Tau、Sirt1和ERK外，还有几个基因或途径也参与小鼠代谢的调节，如自噬损伤[28-29]。研究证明CREB和BDNF确实在miR-132/212敲除小鼠中受到影响[16]。miR-132能够调节Tau蛋白切片和转录因子FOXOLA，这是Tau信号通路的一个因素,与AD的严重程度相关[30]。miR-132主要存在于含有超磷酸化蛋白的神经元中，灰质比白质中更易发生下调。在一个重要的记忆区域——AD患者的细胞核基底细胞中，miR-132呈现出稳定的水平。这一区域的miR-132表达与胆碱乙酰转移酶表达呈正相关，并带有超磷酸化蛋白的副作用[31]。在AD进展中发现miR-132水平变化，表明miR-132可能在最初阶段保持胆碱能功能，而在后期阶段则可能导致神经退化。敲除miR-132/212的小鼠表现出更高水平的Tau表达、磷酸化和聚集，miR-132异位表达可抑制Tau蛋白磷酸化和聚集，miR-132/212敲除的小鼠表现出记忆损伤，还表现为BDNF、CREB、MECP2水平改变[29]。它还通过肌糖蛋白1，4,5-三磷酸激酶B(inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B,ITPKB)的上调加重淀粉样蛋白的沉积，从而导致更高水平的磷酸化蛋白，同时也提高了BACE和ERK1/2蛋白活性[29]。在细胞株和受到氧化应激影响的主要啮齿类动物的神经元中，miR-132/212过表达显示了对神经的保护作用。这些效应是通过蛋白激酶B信号通路的目标来调节的，也就是转录因子FOXO3a，miR-132/212在AD患者中表达升高。miR-132/212水平与Tau病变严重程度相关。miR-132/212缺乏导致Tau聚集，是否存在另一种机制导致Tau聚集，Ucar等[32]发现，自噬在miR-132/212敲除的小鼠中是缺乏的，电子显微镜分析揭示了自噬液泡的大小和数量的净增加，确认在没有miR-132/212的情况下，自噬过程会受到损害。对于3xTg-AD小鼠，miR-132/212治疗可明显改善长期记忆缺陷，可能参与人类和3xTg-AD小鼠的调节胆碱能信号和记忆[33-35]。miR-132具有神经保护特性，调节可存活的磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路，抑制包括FOXO3、P300和第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因在原发性海马和皮质神经元的死亡信号级联。研究发现，在注射抗miR-132动物内，海马体和皮质的淀粉样斑块沉积分别增加了2倍和1.7倍[29]。研究表明ITPKB在AD病理中有双向作用，可以影响BACEI活性导致Aβ产生，同时，通过ERK1/2的磷酸化和活性促进Tua磷酸化，ITPKB与AD患者大脑中的淀粉样样斑块和神经原纤维缠结在一起，并呈现出一种对miR-132的相互排斥的表达模式[35]。实验进一步证明，miR-132下调对Aβ产生的影响是通过下调ITPKB实现的。miR-132直接影响Tau表达，因为MAPK mRNA含有一个miR-132结合位点，这与之前的研究一致[23,36-37]。miR-132通过控制MECP2表达调节树突的可塑性，在出生后，MECP2表达减少会延迟神经元的成熟和突触的形成。早期生长反应因子调节参与突触活动和可塑性的许多基因，且早期生长反应因子也可促进Tau磷酸化，从而破坏细胞骨架，早期生长反应因子上调神经元内的早老素2基因，这是APP水解酶γ-分泌酶的关键辅因子[38]。BDNF与Sirt1是miR-132的目标基因，BDNF参与学习记忆、神经发育、神经元认知、突触可塑性调节、神经元凋亡过程和神经元分化的调节，Sirt1参与应激反应、凋亡的调节、炎症反应、p53结合。血清中BDNF水平与AD患者的认知有关，Aisen[39]发现，BDNF水平越高，痴呆和AD的发生风险越低。

miR-132/212直接调节神经元的一氧化氮合酶。一氧化氮在神经元中由一氧化氮合酶形成，其是神经保护因子还是神经破坏因子取决于细胞氧化应激的水平[38]。一氧化氮合酶高表达可能增加一氧化氮的产生和促进特定蛋白的异常S-亚硝基化，导致AD和其他神经退行性疾病的发生。一氧化氮的大量堆积与神经细胞损伤有关，并被认为是导致包括AD在内的许多神经退行性疾病的原因。与神经退行性病变和Tau蛋白病理有关的特定蛋白质的S-亚硝基(如细胞周期素依赖蛋白激酶5、动力相关蛋白1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶)能增强与疾病相关的Ser396、Ser404和Ser202位点上Tau的磷酸化，损害神经活性。miR-132/212的下调打乱了S-亚硝基的平衡和诱导Tau磷酸化[40]。对700例老年背外侧前额皮质样本的研究证实，miR-132与Tau病理和神经纤维缠结显著相关，且对人类其他Tau病理如额颞叶变性和进行性核上性麻痹的最初分析表明miR-132是下调的[40]。在病理情况下，过量的一氧化氮能有效地促进S-亚硝基附近蛋白硫醇组产生S-亚硝基蛋白，一些蛋白的生物活性受到这种修饰的调节导致蛋白错误折叠、线粒体的分裂、突触破坏、神经毒性信号，最终促进神经退行性变[41]。研究证实miR-132/212抑制导致过量一氧化氮产生，因此影响关键神经元蛋白的S-亚硝基，反过来诱导Tau蛋白的高度磷酸化[40]。miR-132/212在调节AD神经病理机制中起重要作用。

3 结 语

AD的诊断基于综合的临床评估，包括临床症状、神经心理学测试、神经影像、基因测试。复合正电子发射断层摄影术测定大脑Aβ沉积的蛋白质灵敏度为83%～100%，特异度为46%～88%，Aβ42和Tau在AD诊断中的灵敏度和特异度分别为93.5%和82.7%，由于其数据获取具有主观性、侵入性等特点使其在临床中常规应用难以实现[42]。每年有10%～15%的MCI进展到AD阶段，因此对AD的早期表现症状进行早期治疗显得尤为重要，所以诊断工具必须是基于发现AD发展中最早的症状阶段。外周血miR-132/212是一种理想的生物标志物，具有易获取、无创、价廉等优点，可为AD的治疗提供新策略。