ADAM17对血小板GPIbα受体的切割作用——活血化瘀中药的一个作用靶点？*

王海芳，何 锐，成 雅，袁瑞华，董 静，刘勤社△

(1.陕西省及咸阳市中西医结合心血管病防治重点实验室，陕西中医药大学，陕西 西安 712046；2.陕西中医药大学真实世界临床研究院，陕西 西安 712046；3.陕西中医药大学第二附属医院心内科，陕西 西安 712000)

应用抗血小板药物预防和抑制血栓形成是血栓栓塞性心脑血管病和血管支架置入围手术期的重要治疗措施[1]。然而目前所有的抗血小板治疗多伴有出血风险增加，随着用药时间的延长及抗栓药物联用，出现药物抵抗、消化道损伤等不良反应的几率也大大增加[2]。因此，深入研究血小板功能的调控机制，寻找新的安全有效的抗血小板药物，成为当今心脑血管疾病防治领域的国际性关注点[3]。国外学者从血小板结构和功能调控的角度进行了深入的研究，我国众多学者则从中药入手开展研究寻找抗血小板活性成分，均取得了一定的成果。本文将从血小板膜表面黏附受体及其表达的调控，以及中药活性物质对其影响的角度对近年来的研究进展进行综述。

1 血小板表面黏附受体GPIb-IX-V复合物和GPIbα

除止血外，血小板在免疫、炎症、肿瘤转移等方面也具有重要作用[4]。在损伤修复或粥样硬化斑块形成过程中，血小板对受损或活化血管内皮的识别和黏附起着关键性作用。通过一系列高度整合的过程，血小板从快速移动状态转变为在受伤部位缓慢滚动、黏附和激活，再募集更多血细胞形成血栓。血小板与血管内皮细胞、内皮下基质、白细胞等的黏附主要由血小板表面黏附-信号传递受体介导，这些受体多为糖蛋白（glycoprotein，GP），其中 GPIbα 尤为重要[5]。

GPIb-IX-V复合物是血小板表面最重要的黏附受体，GPIbα与GPIbβ以二硫键相连接，再与GPIX和GPV非共价连接组成GPIb-IX-V。GPIbα的细胞外N-末端是其配体结合区域。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 是 GPIb-IX-V 复合物的主要配体之一。在血液流体剪切力作用下，一端固定的vWF结构部分展开，功能结构域暴露，与GPIbα的N-末端相互作用，GPIbα胞外区域还有感知流体剪切应力并影响vWF与GPIbα结合的功能，故vWF与GPIb-IX-V复合物之间的结合对血流变化非常敏感[6]。vWF还可同时与胶原纤维和血小板结合。血管破裂时，大量血小板以vWF为中介黏附在胶原纤维上形成血栓。因此，GPIbα的胞外域N-末端是血栓形成所必需。此外，凝血因子XI和XII、凝血酶、白细胞整合素αMβ2、P-selectin等许多其它分子也能结合到此部位，在凝血和先天免疫应答中发挥重要作用[7]。

GPIbα胞外域还可通过影响胶原纤维与其受体GPVI的结合来调节血小板活化的速度和程度[7]。GPIb-IX-V复合物和GPVI与其各自配体的结合可协调血小板对裸露内皮下基质的反应性。研究表明，GPIbα也参与血小板存活的调节，抗体或寒冷诱导GPIbα在血小板表面上聚集成簇或形成二聚体可导致循环血小板被迅速清除[8]。因此，保证血小板膜上GPIbα的相对密度和功能对于维持血小板的黏附聚集功能和激活效率极为重要[9]。血小板膜受体已成为血小板相关疾病治疗药物研究与设计的重要靶点[10]。

2 ADAMs家族成员对血小板黏附受体的调控

循环血小板膜受体水平和功能如何精细调节，目前仍未完全阐明。有核细胞可通过调节基因转录的方式进行受体更新，但血小板中不存在此机制。在金属蛋白酶的作用下，胞外结构域发生水解脱落（ectodomain shedding）是一种快速、不可逆的膜蛋白调控机制。胞外域脱落现象存在于许多细胞类型，对多种细胞生物学过程进行调节，是一种高效率蛋白质翻译后调控机制。去整合素金属蛋白酶家族（A Disintegrin And Metalloproteinases，ADAMs）是胞外域剪切脱落的主要承担者，ADAM17是其最为重要的成员，被称为细胞中的“分子剪刀”[11]。

ADAM17是一种I型金属蛋白酶，其最著名的底物分子为pro-TNF-α，作用后释放出游离TNF-α，故又称为TNF-α转化酶（tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE）。目前已知ADAM17底物超过80种，包括多种细胞因子、生长因子、受体或黏附分子等，因此在机体发育、炎症和疾病过程中发挥重要作用[12]。ADAM17因释放TNF-α而诱发炎症反应，并可诱导表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的配体脱落而激活EGFR信号、维持表皮屏障功能，是机体抵御损伤和感染的第一道防线。ADAM10是ADAMs家族中另一个重要成员，主要在中枢神经系统具有重要作用[13]。ADAM17和ADAM10的底物存在一定的交叉，可发生功能代偿现象[14]。研究表明，血小板膜受体GPIbα的水平主要受ADAM17的调控，ADAM10主要作用于GPVI[15]。

GPIb-IX-V复合物和GPVI与其各自相应配体结合，激活血小板内信号通路后，随即迅速引起GPIbα和GPVI的胞外配体结合片段发生不可逆的剪切脱落，避免了血小板的过度激活。Bergmeier等报告，ADAM17对人血小板受体GPIbα在细胞外近膜区进行剪切后产生大小约110-130kDa的可溶性GPIbα 片段（glycocalicin，GC）[16]，但其功能不明。研究显示，在ADAM17基因表达抑制的LDLR-/-小鼠中，喂食高脂肪饮食形成的动脉粥样硬化病变的面积明显增大[17]，不过并未出现明显的凝血障碍，可能与存在其他代偿机制有关。

3 ADAM17的激活

ADAM17蛋白的分子结构组成包含一个N末端信号序列、一个前结构域、一个金属蛋白酶或催化结构域、一个解整合素结构域、一个富含半胱氨酸的膜近端结构域、一个单次跨膜结构域和细胞内部分，各部分结构在ADAM17的成熟、转位、活性调控和底物选择性方面发挥调节作用。ADAM17的激活是一个受到严密调控的过程。ADAM17前蛋白的修饰、其磷酸化和向细胞膜的转位，都是影响酶活性的重要因素。在不同细胞类型进行的研究中，PKC、ROS、钙离子、p38 MAPK，以及 ERK、AKT等均报告有参与ADAM17的激活和对底物的剪切作用。

在非血小板细胞上进行的研究表明，PMA激活PKC可促使成熟ADAM17向细胞膜表面移动；在血小板中则可增强血小板表面ADAM17的活性。PKC可诱导ADAM17的磷酸化；PKC的许多不同亚型参与ADAM17激活，可能与细胞类型有关[18]。

Brill等报告，在体外以过氧化氢诱导血小板氧化应激，可激活ADAM17并诱导GPIbα胞外剪切脱落，机制研究显示这种ADAM17激活作用依赖于p38 MAPK信号，而与血小板活化、PKC、PI3K和凋亡信号通路无关，提示氧化应激是激活ADAM17、影响血小板受体，对其聚集功能进行调控的一种机制[19]。血小板储存病变指的是血小板储存过程中受体脱落和耗竭、使得输血后血小板的存活率和功能都显著下降，也与线粒体损伤引起p38 MAPK的磷酸化激活有关[20]。

线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）在血小板活化或凋亡中起关键作用，mPTP抑制剂对钙离子载体A23187诱导的GPIbα胞外脱落发挥抑制作用，而mPTP增效剂则可具促进作用。此外，A23187诱导的线粒体Ca2+升高可引发mPTP开放，促进线粒体ROS产生，后者诱发ADAM17介导GPIbα胞外域脱落[21]。Zhang等[22]也报告，胶原蛋白、凝血酶和A23187都能诱导血小板ROS产生，同时引起GPIbα胞外域脱落，ROS清除剂抑制GPIbα脱落。在小鼠成纤维细胞和CHO细胞中，ATP激活 P2Y受体、诱导 ADAM17-依赖性TGF-α释放、激活EGFR信号，线粒体ROS和Ca2+也发挥重要作用[23]。

最近研究发现，iRhom（protease-inactive rhomboids）家族成员iRhom1和 iRhom2是ADAM17的重要调节分子，在分泌途径中ADAM17的运输需要与iRhom2相结合。iRhom2磷酸化与ADAM17对底物的酶解活性也有关系，可能还参与对底物的选择作用。血小板中仅发现有iRhom2表达，故通过作用于iRhom2而激活ADAM17可能是开发选择性地作用于血小板的药物的一个切入点[24]。Chapnick等[25]研究认为ADAM17的激活机制具有明显的细胞类型特异性。

4 内外源性物质通过影响ADAM17而调节血小板及其他细胞的功能

最早报告可直接影响血小板受体表达的药物正是抗血小板药物阿司匹林，其在高剂量下可体外诱导血小板GPIb和GPV脱落；同时阿司匹林也可诱导中性粒细胞表面L-selectin脱落，这些作用都依赖于其对ADAM17的激活[26]。

Duerschmied等报告，5-羟色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）与血小板膜5-HT2AR结合后可诱导血浆和细胞培养上清中脱落的GPIbα胞外片段含量升高，而在 ADAM17 基因敲除（ADAM17ΔZn/ΔZn）血小板中，5-HT的作用抑制，表明此作用由ADAM17介导；5-HT激活ADAM17的作用与p38有关，似与G蛋白无关[27]。Hirata等采用iPSC（induced pluripotent stem cells，人诱导多能干细胞）生产血小板过程中发现，利用KP-457抑制iPSC中ADAM17后产生的血小板GPIbα胞外脱落的程度较轻，血小板聚集功能更好[28]。

肠道内皮细胞中毒蕈碱型乙酰胆碱M3型受体激活后，通过活化ADAM17而促使细胞膜TNFR1剪切脱落，抑制TNF-α对粘膜屏障的破坏，M3受体介导作用决于Gαq/11蛋白和p38，同时p38也参与了ADAM17介导的EGFR激活和ERK1/2激活，对于粘膜屏障发挥保护作用[29]。此外，angiotensin II、IL-1、ATP等也可激活特异性GPCR、ADAM17活性增强而调控EGFR等细胞内信号。可以说，ADAM17是GPCR介导信号的传导者，也是细胞受体信号相互交流的关键分子。

组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）包括 TIMP 1-4，是体内天然的金属蛋白酶抑制剂，也是细胞膜蛋白脱落事件的关键调节因子。TIMP-3是ADAM17的有效抑制剂，但TIMP3抑制ADAM17而产生的确切后果尚不明确[30]。

5 活血化瘀中药对ADAM17的调控

血瘀证是心血管病常见的中医证型，同时可见于几乎所有西医疾病的部分病程阶段、甚至全过程。从西医基础医学的角度看，血瘀证的主要病理表现是血液循环障碍，包括血液流变学异常、血流动力学改变、凝血亢进、血小板活化聚集、血栓形成和血管腔狭窄等，而形成血瘀证后又可引发多种更为严重的病变。中医认为其病机主要是瘀血内阻，治以活血化瘀。临床上，活血化瘀法治疗心血管系统疾病，特别是作为冠心病[31]和病理性血栓形成[32]的辅助用药，疗效颇佳。

常用活血化瘀中药有赤芍、川芎、丹参、红花、桃仁、乳香、没药等，常同补气、养血、温经散寒、清热、行气、攻下等治法配合使用。例如，陈可冀院士治疗冠心病支架置入术后血瘀证常用赤芍、川芎、红花和丹参[31]。现代药理学研究表明，活血化瘀药物治疗心血管疾病的机制主要包括：（1）抗血小板聚集；（2）改善血管内皮功能；（3）调节炎症因子表达；（4）抑制氧化应激；（5）调脂、稳定斑块；（6）增加冠状动脉血流量[33]。可见抗血小板聚集是活血化瘀药物发挥作用的一个重要方面，三七、红花、川芎、益母草等中药对血小板聚集的抑制作用已得到实验验证；活血化瘀中药调控血小板功能的机制主要是抑制其与功能障碍的血管内皮细胞之间的黏附，或可直接抑制血小板激活和聚集，然而其作用机制和作用靶点目前尚有待进一步阐明[34]。活血化瘀中药是否可通过如前所述的ADAM17/GPIbα途径调控血小板功能，目前尚未见报告。

血管内皮功能失调是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成的始动因素和必备条件，同时也与血小板黏附和血栓形成密切相关[35]。许多药物可通过抑制氧化应激、调节炎症因子表达、抑制细胞内炎性信号通路等途径而改善血管内皮功能，抑制AS的发展。本课题组在前期开展国家自然科学基金项目“基于TACE剪切作用研究活血胶囊对动脉粥样硬化的抗炎机制（81573823）”的过程中，研究了活血胶囊及某些中药活性单体对血管内皮细胞的抗炎机制，发现红花主要活性成分羟基红花黄色素（hydroxyl-safflower yellow A，HSYA）、赤芍主要活性成分芍药苷（paeoniflorin，PF）、黄芪中所含黄芪皂苷 III（astragalaside III，AS-III），以及活血胶囊均可诱导血管内皮细胞中的ADAM17酶活性升高。HSYA激活ADAM17后引起细胞膜TNFR1剪切脱落，抑制细胞中TNFR1/NF-κB信号激活和黏附分子-1（ICAM-1）的表达，进而抑制巨噬细胞和内皮细胞黏附[36]。PF激活内皮细胞ADAM17后，不仅引起TNFR1剪切脱落和NF-κB信号抑制，还介导EGFR反式激活及下游保护性信号激活，发挥抗氧化和抗炎作用；PF通过诱导ADAM17磷酸化而使之激活[37]。在动脉平滑肌细胞中，我们发现AS-III可抑制TNFR1/NF-κB信号激活[38]；随后研究显示，AS-III的作用也与激活ADAM17、诱导TNFR1脱落有关，且同时可诱导EGFR反式激活；进一步研究表明AS-III通过激活p38而诱导ADAM17磷酸化。与此同时，我们发现活血胶囊也可诱导血管内皮细胞中ADAM17磷酸化，激活EGFR信号和抑制TNFR1/NF-κB信号（数据待发表）。以上研究提示，ADAM17是活血化瘀药物抑制血管内皮细胞炎症，进而抑制内皮细胞与白细胞、血小板黏附，发挥对心血管“活血化瘀”作用的一个重要靶点。

黄芪是一味重要的益气活血中药。除本课题组对AS-III的研究外，Gu等[39]报告，黄芪甲苷（AS-IV）可激活转录因子Nrf2而诱导抗氧化酶血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）等抗氧化酶的表达，其作用机制与诱导HB-EGF释放、反式激活EGFR信号有关。Chen等[40]也报告，AS-VI具有促进神经干细胞增殖和自我更新的功能，其作用与激活EGFR/MAPK信号通路有关。尽管上述研究并未对AS-VI诱导HB-EGF释放或EGFR激活的机制进行深入研究，笔者推测可能与激活ADAM17或其类似物有关。本课题组研究显示，活血胶囊亦可诱导PI3K/AKT/Nrf2/HO-1信号通路激活，从而对血管内皮细胞发挥抗氧化作用[41]；同时发现活血胶囊可诱导血管内皮细胞中ADAM17活化，而且PI3K/AKT/Nrf2的激活可为ADAM17抑制剂所抑制（数据待发表），提示ADAM17是活血胶囊激活抗氧化信号通路的关键环节。

以上研究显示，血管内皮细胞中的ADAM17可为活血化瘀中药单体或复方活血胶囊激活，通过切割细胞表面的炎症相关分子TNFR1、EGFR受体来发挥抗炎作用，那么这些药物是否可以同时激活血小板中ADAM17，通过对GPIbα途径发挥切割作用、减少其配体结合位点而抑制血小板黏附聚集功能，发挥“活血化瘀”作用，是一个非常令人感兴趣的问题。课题组的前期研究显示，在离体血小板中，HSYA、PF和活血胶囊的确可迅速诱导GPIbα的胞外片段脱落至培养液中（数据待发表），其进一步的作用机制和生理学意义正在研究中。

由于ADAM17在体内几乎所有细胞广泛表达，底物又十分多样[42]，因此在不同细胞类型中ADAM17激活后产生的效应与细胞的功能密切相关[43-44]。笔者推测，激活内皮细胞中的ADAM17，诱导TNFR1和其他炎性分子如（Toll-Like Receptor 4，TLR4）脱落而抑制炎症反应[44]；同时激活血小板 ADAM17，诱导GPIbα脱落，抑制血小板黏附功能，进一步影响血小板与血管、白细胞、肿瘤细胞等的相互作用，可能是活血化瘀药物发挥作用的两个方面。血小板ADAM17很可能是中药活血化瘀作用的重要物质基础之一。